潰結寧膏對慢性非特異性潰瘍性結腸炎大鼠血清中炎癥因子及結腸組織GFAP、BDNF的影響

王璇 李擎虎

〔摘要〕 目的 研究潰結寧膏對于大鼠血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）和結腸組織中膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）、腦源性神經營養因子（brain derived neurophic factor， BDNF）的影響。方法 選用健康雄性2月齡SD大鼠48只，隨機分為空白組、模型組、水楊酸柳氮磺胺吡啶組、潰結寧膏組，每組12只，采用3% DSS間斷性喂養建立慢性非特異性潰瘍性結腸炎模型，潰結寧膏組選取“中脘”“氣?！薄白闳铩薄疤鞓小奔啊捌⒂帷毖ㄎ毁N敷，連續治療21 d。治療后第1～3周周末觀察大鼠體質量變化，進食、活動及糞便情況，并計算結腸組織疾病活動指數（disease activity index， DAI）;HE染色觀察各組大鼠結腸組織病理變化情況;ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量;蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠結腸組織中GFAP、BDNF蛋白表達。結果 在治療的第7、14、21天，潰結寧膏組大鼠的DAI評分均明顯低于模型組（P<0.01）。電鏡下，潰結寧膏組大鼠結腸組織病理改變恢復，炎性浸潤減輕。與模型組比較，潰結寧膏組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低（P<0.01）;結腸組織中GFAP蛋白表達明顯降低，BDNF蛋白表達明顯升高（P<0.01）。結論 潰結寧膏可能通過減輕血清中炎性因子的表達、調控腸神經系統、修復腸壁神經叢和保護腸黏膜，減輕結腸組織病理性損傷，從而緩解慢性非特異性潰瘍性結腸炎的臨床癥狀、降低DAI。

〔關鍵詞〕 慢性非特異性潰瘍性結腸炎;潰結寧膏;白細胞介素-1β;白細胞介素-6;腫瘤壞死因子-α;膠質纖維酸性蛋白;腦源性神經營養因子;疾病活動指數

〔中圖分類號〕R259 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.009

〔Abstract〕 Objective To study the effects of Kuijiening Ointment on interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， tumornecrosis factor-α （TNF-α） in rat serum and glial fibrillary acidic protein （GFAP） and brain derived neurotrophic factor （BDNF） in colon tissue. Methods 48 healthy male SD rats of 2 months old were selected and randomly divided into blank group， model group， salicylic acid sulfasalazine （SASP） group， Kuijiening Ointment group， 12 rats in each group， a chronic nonspecific ulcerative colitis model was established with intermittent feeding using 3% DSS. The Kuijiening Ointment group selected “Zhongwan （RN12）”， “Qihai （RN6）”， “Zusanli （ST36）”， “Tianshu （ST25）” and “Pishu （BL20）” acupoint application for 21 days. In the 1st to 3rd week after treatment， the changes in body weight， eating， activity and feces of the rats were observed， and the disease activity index （DAI） of colon tissue was calculated; HE staining was used to observe the pathological changes of the colon tissue of rats in each group; ELISA method was used to detect the serum levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α in each group of rats; Western blot method was used to detect the expression of GFAP and BDNF protein in the colon tissue of each group of rats. Results On the 7， 14， and 21 days of treatment， the DAI score of the Kuijiening Ointment group was significantly lower than that of the model group （P<0.01）. Under electron microscope， the pathological changes of the colon tissue of the rats in the Kuijiening Ointment group recovered， and the inflammatory infiltration was reduced. Compared with model group， the serum levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α in the Kuijiening Ointment group were significantly reduced （P<0.01）; the expression of GFAP protein in the colon tissue was significantly reduced， and the expression of BDNF protein was significantly increased （P<0.01）. Conclusion Kuijiening Ointment may relieve the clinical symptoms and decrease DAI of chronic non-specific ulcerative colitis by reducing the expression of serum inflammatory factors， regulating the enteric nervous system， repairing the nerve plexus of the intestinal wall， protecting the intestinal mucosa， and reducing the pathological damage of the colon tissue.

〔Keywords〕 chronic nonspecific ulcerative colitis; Kuijiening Ointment; interleukin-1β; interleukin-6; tumor necrosis factor-α; glial fibrillary acidic protein; brain derived neurotrophic factor; disease activity index

慢性非特異性潰瘍性結腸炎（chronic nonspecific ulcerative colitis， CUC）是臨床多發的一種原因不明的腸道炎癥[1]，好發于直腸和乙狀結腸的腸黏膜下層，但也可遍及整段結腸[2]。臨床常表現為腹瀉、腹痛及黏液、血便，病情輕重不一，遷延反復?，F代醫學認為，其可能與感染、自身免疫、變態反應、遺傳因素等有關[3]。由于其發病機制尚不明確，故無特效治療方案，臨床普遍采取保護腸黏膜、抗炎、清除致病源等對癥治療[4]。潰結寧膏具有溫補脾腎之功效，用于CUC的長期治療具有良好療效且無明顯毒副作用，深受患者信賴。經過長期臨床觀察[5-7]和大量實驗研究[8-10]，潰結寧膏療效得到進一步肯定。此次研究旨在闡述潰結寧膏對于大鼠血清中炎性因子和結腸組織中膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein， GFAP）、腦源性神經營養因子（brain

derived neurophic factor， BDNF）的影響，為潰結寧膏治療CUC的有效性和科學性提供更深層次的理論依據。

1 材料與方法

1.1 &nbsp;動物

健康雄性2月齡SD大鼠48只，體質量（160±10） g，均購自湖南斯萊克景達實驗動物中心，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。飼養條件：12 h/12 h明暗交替，室溫（25±3） ℃，相對濕度65%，噪聲

≤60 dB，適應性喂養1周后開始造模。本實驗符合動物實驗倫理要求。

1.2 ?藥物

潰結寧膏（湖南中醫藥大學第二附屬醫院自制，由炮附子、細辛、丁香、白芥子、延胡索、赤芍、生姜組成）。水楊酸柳氮磺胺吡啶（salicylazo sulfapyridine，

SASP）片（山西同藥集團，國藥準字H11020818，規格0.25 g/片），用雙蒸水將濃度配成50 mg/mL，放入4 ℃冰箱保存備用。

1.3 ?主要試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium， DSS）（美國MP Biomedicals公司，S0749），水合氯醛（上海山浦化工，20210123）;beta-Actin（北京BIOSS，AH11295376）;HRP-羊抗兔IgG（武漢BOSTER，BST15H08A27H55）;Anti-BDNF Antibody（武漢BOSTER，BST20315317）;Anti-GFAP Antibody（美國CST，3512T3）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢BOSTER，15H18B58）;特超敏ECL化學發光液（武漢BOSTER，14E22B45）;伊紅染液、蘇木素染液（武漢Servicebio，ZH201294、ZH209293）;白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）ELISA試劑盒（美國RD公司，BMS2302、BMS2040、BMS2017）。

Mini-Proten Tetra System電泳系統（美國Bio-Rad公司）;石蠟切片機（德國徠卡，RM2235）;BX43光學顯微鏡（Olympus公司，IX73-U）;多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司，SpectraMax5）;高速冷凍離心機（日本日立，CR22G Ⅱ）;凝膠成像系統（美國伯樂，Gel Doc XR+）。

1.4 ?動物造模及分組

采用隨機數字表法將48只大鼠分為空白組、模型組、SASP組、潰結寧膏組，每組12只。根據文獻研究[11-12]，采用3% DSS間斷性喂養建立CUC模型。模型組、SASP組、潰結寧膏組自由飲用3% DSS溶液7 d，間隔7 d，按此順序持續造模35 d，空白組正常飲用水。按照Cooper評分系統[13]根據小鼠體質量減輕、大便性狀、便血情況評定大鼠結腸組織疾病活動指數（disease activity index， DAI），以DAI大于5分及大鼠結腸病理性改變視為造模成功。見表1。

1.5 ?干預方法及DAI測定

選穴參考《實驗針灸學》[14]，選“中脘”“氣?！?“足三里（雙側）”“天樞”及“脾俞”，大鼠選穴后備皮，貼敷后予鼠夾固定;空白組和模型組給予巴布劑基質穴位敷貼加生理鹽水（5 mL/kg）灌胃;SASP組給予巴布劑基質穴位敷貼加SASP溶液，根據人臨床用量的等效劑量和動物體表面積計算[15]，SASP溶液按照每天0.27 g/kg濃度灌胃給藥;潰結寧膏組給于潰結寧膏貼敷加生理鹽水（5 mL/kg）灌胃，每只大鼠每天貼敷2 h，持續21 d。治療后第1～3周周末觀察大鼠體質量變化、進食、活動及糞便情況，根據體質量下降、糞便性狀和隱血情況，計算DAI。

1.6 ?HE染色觀察結腸組織形態

大鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉，立即暴露腹腔及胸腔，以生理鹽水行心臟灌注，待肝臟顏色變淡時停止灌注，快速取結腸組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分。一部分放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅染色，鏡下觀察結腸組織形態。一部分存于-80 ℃冰箱用于蛋白免疫印跡檢測。

1.7 ?ELISA法測定各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量

大鼠行心臟灌注前，腹主動脈取血，4 ℃靜置4 h，4 ℃、3500 r/min，離心10 min，離心半徑7 cm，取上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀在450 nm處讀取各孔吸光度，通過標準曲線計算每個樣品蛋白水平。

1.8 ?蛋白免疫印跡法檢測結腸組織中GFAP、BDNF蛋白含量

取適量結腸組織冰上勻漿，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，離心半徑7 cm，收集上清-80 ℃凍存備用。BCA 法對蛋白定量。適量蛋白樣品進行電泳分離，5%濃縮膠60 V，10%分離膠90 V;然后濕轉90 min，電流300 mA，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗GFAP（1∶1000）、BDNF（1∶500），4 ℃搖床過夜。次日，TBST漂洗3次，二抗（1∶10 000）室溫孵育90 min，TBST漂洗3次，添加ECL發光液暗室曝片。用ImageJ V1.8.0軟件分析各條帶灰度值，進行定量分析，統計各組與β-actin灰度值的比值。

1.9 ?統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。實驗數據以“x±s”表示，組間數據比較采用方差分析，用LSD法（方差齊）或Dunnett’s T3（方差不齊）作組間多重比較。均以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ?各組大鼠一般情況觀察

空白組大鼠在治療前后毛色柔潤光澤，無體質量下降，無稀便膿血便情況。模型組大鼠在造模7 d后出現飲食減少、畏寒蜷縮、毛色晦暗、大便次數增多等表現，部分大鼠甚至出現明顯血便;造模35 d時，模型組大鼠體質量明顯下降，少食懶動，抱團蜷縮，毛色枯槁，大便呈黏液狀，重者夾帶膿血。由于造模周期長，少數大鼠因感染而死亡（模型組2只、SASP組1只、潰結寧膏組2只）。SASP組、潰結寧膏組治療后大便次數逐漸減少，黏液膿血便減少或消失，進食及飲水量增加，毛發逐漸恢復光澤，體質量停止下降。

2.2 ?各組大鼠DAI評分比較

治療前，模型組、SASP組及潰結寧膏組大鼠DAI評分比較，差異無統計學意義（P>0.05）。在治療的第7天、第14天、第21天，SASP組和潰結寧膏組的DAI評分均明顯低于模型組（P<0.05，P<0.01）。與潰結寧膏組相比，SASP組在治療第21天的DAI評分明顯降低（P<0.05）。見表2。

2.3 ?各組大鼠結腸組織形態學觀察

電鏡下觀察發現，模型組大鼠結腸組織出現明顯黏膜損傷，局部出現腺體排列紊亂和炎性細胞浸潤，腸壁增厚。SASP組及潰結寧膏組結腸組織病理改變不同程度恢復，黏膜腺體排列較整齊，腸壁基本恢復，肌層病變減輕，炎性浸潤減輕。見圖1。

2.4 ?各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，SASP組、潰結寧膏組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低（P<0.01）;SASP組與潰結寧膏組之間無明顯差異（P>0.05）。見圖2。

2.5 ?各組大鼠結腸組織中GFAP、BDNF蛋白表達比較

與空白組相比，模型組大鼠結腸組織中GFAP蛋白表達明顯升高、BDNF蛋白表達明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，SASP組、潰結寧膏組大鼠結腸組織中GFAP蛋白表達明顯降低、BDNF蛋白表達明顯升高（P<0.01）;SASP組和潰結寧膏組之間比較無明顯差異（P>0.05）。見圖3。

3 討論

CUC當屬中醫學“泄瀉”“腸澼”“痢疾”“內瘍”等范疇，其病因無外乎感受外邪、飲食不節、情志失調、脾腎失司四端[15-16]。本課題組朱瑩教授認為，其病位在腸，與脾、腎緊密相關;慢性持續活動期以脾腎陽虛為本，夾濕熱、瘀血、積滯并見;急性發作期則以濕熱、瘀血、積滯更甚，兼以脾腎不足，病情遷延難愈，惡性循環。朱教授根據其病因病機并結合多年臨床經驗首創潰結寧膏，由炮附子、細辛、丁香、白芥子、延胡索、赤芍、生姜組成，全方共奏溫腎暖脾、活血化瘀之功效[17]。課題組前期體外透皮實驗證實，潰結寧膏有良好的透皮效果，具有起效快、療效持久的特點[18]。在經穴-臟腑相關理論指導下，選胃經的募穴“中脘”，大腸經的下合穴“足三里”及募穴“天樞”，脾之背俞穴“脾腧”，以及具有補腎固元作用的“氣?！边M行潰結寧膏敷貼，依據經絡“聯系上下，溝通表里”，使藥性貫經絡傳至臟腑，發揮治療作用。

本實驗采用3% DSS間斷性灌胃造模，該造模方法操作簡便，性價比高，重復性好，是結腸炎建模的首選方法[19]，并且可根據實驗目的調整DSS濃度和給藥時間，建立慢性、急慢性交替模型或結腸癌模型[20]。本次實驗結果表明，模型組DAI評分明顯升高且大鼠結腸組織發生明顯病理改變，提示造模成功。經過21 d治療，SASP組、潰結寧膏組大鼠一般情況明顯好轉，DAI評分明顯降低（P<0.05，P<0.01）且大鼠結腸組織病理改變明顯減輕，提示潰結寧膏可以改善慢CUC大鼠的生存質量及腸道的病理性改變。

IL-6、IL-1β和TNF-α是重要的促炎癥細胞因子[21]。研究表明，抗炎因子與炎性因子動態失衡與炎癥性腸病的發生和發展密切相關，通過檢測血清中IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子水平可判斷病情進展及嚴重程度[22]。本次實驗中模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高（P<0.01），SASP組及潰結寧膏組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均不同程度降低（P<0.01），提示潰結寧膏能一定程度上抑制機體的炎癥反應，糾正機體抗炎因子與炎癥因子的失衡。

近年來研究已證實，腸神經系統（enteric nervous system， ENS）尤其是腸神經膠質細胞（enteric gilal cell， EGC）作為一個新興因素在維持及修復炎癥性腸病腸壁完整性過程中起著重要的作用[23]，同時研究顯示[24]，EGC還參與了腸道動力的調控過程，而EGC主要分泌GFAP。同時EGC還可通過自身分泌的神經營養因子、神經多肽及細胞因子等神經遞質直接作用于腸黏膜免疫細胞影響腸黏膜免疫系統，并與炎癥性腸病的發生發展有密切關系。EGC分泌的神經營養因子主要包括神經生長因子（nerve growth factor， NGF）和膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line derived

neurotrophic factor， GDNF）、BDNF等[25]。有文章報道，BDNF與腸道炎癥和腸道高敏感密切相關，腸道低度炎癥可刺激BDNF的分泌，作用于ENS調節腸道動力和高敏感性[26-27]。此次實驗結果表明，模型組大鼠結腸組織中GFAP明顯升高、BDNF明顯降低（P<0.01）;SASP組、潰結寧膏組大鼠結腸組織中GFAP明顯降低、BDNF明顯升高（P<0.01），提示潰結寧膏可能通過調控ENS系統，進而影響結腸組織中GFAP、BDNF含量，達到改善腸道動力和降低腸道高敏感性的治療目的，減輕CUC的癥狀。

綜上，潰結寧膏可能通過減輕血清中炎性因子的表達、調控ENS系統、修復腸壁神經叢和保護腸黏膜，減輕結腸組織病理性損傷，從而緩解CUC的臨床癥狀、降低DAI。但此次實驗只是對腸神經系統的一個初步探索，未涉及到中樞神經系統與腸道炎癥的聯系，今后還需設計更加合理和科學的實驗研究，對其療效機制進一步深入探索。

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