1株假單胞菌oprD基因缺失和回補載體的構建

朱艷容 劉志新 楊靖 韓韻 陳果 徐祥

摘要 [目的]構建假單胞菌毒性基因（oprD）缺失突變株，為進一步探討其編碼的毒力因子功能奠定基礎。[方法]利用pEX18Gm質粒作為基因敲除的載體，構建假單胞菌oprD 基因重組自殺質粒，通過同源重組并激活自殺基因方式，篩選到目的基因缺失的突變株，再利用pBBR1MCS-2質粒作為目的基因回補的載體，構建回補載體。[結果]同源重組后，經過慶大霉素和氯霉素雙抗平板、蔗糖平板篩選和PCR鑒定，成功獲得了oprD基因缺失突變株，類似操作獲得了回補菌株。[結論]基因缺失突變株的成功構建可為下一步的毒性機理研究奠定基礎。

關鍵詞 假單胞菌;毒力因子;基因敲除;基因回補

中圖分類號 S 188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2022）02-0109-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.02.029

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Construction of oprD Gene Deletion and Complement Vector of Pseudomonas sp.

ZHU Yan-rong1，2，LIU Zhi-xin1，YANG Jing1 et al（1. Basic Medical College， Hubei University of Medicine， Shiyan， Hubei 442000; 2.Hanjiang River Bureau of Hydrology and Water Resources Survey， Xiangyang， Hubei 441000）

Abstract [Objective]To construct Pseudomonas virulence gene （oprD） deletion mutant，and lay the foundation of function for the virulence factor encoded.[Method]We constructed Pseudomonas oprD using pEX18GM plasmid as the vector of gene knockout.The mutant strain with target gene deletion was screened by homologous recombination and activation of suicide gene.The plasmid pBBR1MCS-2 was used as the vector of target gene complement，and the complement vector was constructed.[Result]The results showed that the mutant strain was subjected to gentamicin and chloramphenicol double resistance plate.Through sucrose plate screening and PCR identification，the oprD gene deletion mutant strain was successfully obtained.Similar operation obtained the complement strain gene deletion mutant strain.[Conclusion]The successful construction laid a foundation for further study of toxicity mechanism.

Key words Pseudomonas;Virulence factor;Knockout;Complement

基金項目 湖北省教育廳指導性項目（B2016113）。

作者簡介 朱艷容（1985—），女，湖北咸寧人，高級工程師，碩士，從事水環境監測研究。*通信作者，講師，碩士，從事病原微生物研究。

收稿日期 2021-05-12;修回日期 2021-06-15

假單胞菌屬（Pseudomonas）細菌是桿狀或稍彎的革蘭染色陰性桿菌，菌體大小約為（0.5～1.0）μm ×（1.5～4.0）μm，不形成芽胞，有莢膜;某些假單胞菌株能產生熒光色素，如紅、藍、黃等水溶性色素，有些則具有較強的分解有機物的能力[1-3]。假單胞菌是廣泛存在的環境微生物，在土壤、空氣、水、動植物體內均有分布，該屬中有許多致病菌，能引發動植物疾病[4-7];另外，假單胞菌屬細菌在生物技術應用領域也有著巨大的潛力[8-10]。

該試驗所用細菌是從東湖水域中篩選獲得高產鐵載體假單胞菌，其產鐵載體的機制與其他假單胞菌不同，前期研究表明，其發揮毒性作用而導致線蟲死亡。由于其產鐵載體的機制與其他已知的假單胞菌不同，故其可能有特殊的毒性機制[11-13]。利用轉座子插入突變株的構建和毒性相關基因的多次篩選，得到一些與細菌毒性相關的基因，以其中1個oprD為研究對象，擴增目的基因上下游片段，再利用同源重組交換方法，構建oprD基因缺失載體，同時構建回補菌株，從分子生物學方向揭示HYS菌株的毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒。高產鐵載體假單胞菌、大腸桿菌E.coli DH5α感受態細胞、克隆載體pEX18Gm、回補載體pBBR2由武漢大學謝志雄教授惠贈。

1.1.2 主要試劑。甘油（BIOSHARP）、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素（普博欣）;基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒（天根生物）;內切酶、T4 DNA連接酶、2×PCR Taq Mix（Takara 公司）;Gold View（賽百盛生物）;三氯甲烷、異丙醇、乙醇、蔗糖、氯化鈉（國藥集團）;蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉（美國BD公司）。

1.1.3 引物及測序。引物根據 NCBI 序列設計（表1），由生工生物工程合成。 該試驗所有相關 DNA 測序工作均由華大基因完成。

1.1.4 主要儀器。PCR 儀（Veriti，Applied Biosystem 公司）;全自動凝膠成像系統（美國Protein Simple公司）;水平電泳儀（Bio-Rad 公司）;移液器、離心機（Eppendorf 公司）;恒溫搖床、恒溫培養箱（上海世平實驗設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 假單胞菌基因組提取。將活化后的HYS菌液按1%轉接到新的LB中培養6 h離心去上清;用天根生物試劑公司的基因組試劑盒抽提假單胞菌基因組DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 基因敲除菌株的構建。

1.2.2.1 待敲除基因上下游片段的擴增與回收。根據已知的HYS基因序列，定位oprD基因上下游長度約350 bp大小的序列通過軟件Primer Premier 5.0設計引物擴增。反應體系50 μL：去離子水20 μL;2×Taq mix 25 μL; Primer 1 2 μL;Primer 2 2 μL; HYS DNA 1 μL。反應程序105 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s;58 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s，循環30次;72 ℃延伸10 min。PCR反應后，用天根生物試劑公司的膠回收試劑盒對目的條帶回收。

1.2.2.2 基因上下游片段與敲除載體的連接。膠回收的上游基因片段用Xba Ⅰ 和Sac Ⅰ 雙酶切，下游片段用Sac Ⅰ 和Eco RⅠ 雙酶切，酶切體系20 μL，其中去離子水6 μL，10×FastDigest Buffer，2 μL，PCR purified （0.2 μg）10 μL，FastDigest enzyme 1 1 μL，FastDigest enzyme 2 1 μL。質粒pEX18Gm用Xba Ⅰ 和 Eco RⅠ 雙酶切（圖1）。酶切體系20 μL，其中，去離子水13 μL，10×FastDigest Buffer 2 μL，plasmid DNA（1 μg）3 μL，FastDigest enzyme Xba I 1 μL，FastDigest enzyme Eco RI 1 μL。然后加T4連接酶放入16 ℃恒溫箱孵育3 h。

1.2.2.3 轉化過程及轉化子鑒定。將孵育好的20 μL連接體系加入100 μL感受態細胞混勻，冰浴30 min后42 ℃熱激90 s，立即置于冰上，2 min后補加LB液體培養基，37 ℃水浴。離心去上清后用LB懸浮細胞并涂布抗性平板。37 ℃孵育過夜。選取平板上的轉化子進行PCR鑒定，反應體系10 μL，其中，去離子水4.0 μL，2×Taq max 5.0 μL，M13F 0.5 μL，M13R 0.5 μL，菌落（轉化子）1個。反應程序：105 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火90 s;72 ℃延伸30 s，循環30次;72 ℃延伸10 min。PCR反應后，凝膠電泳并觀測所得條帶是否正確。正確條帶的菌株送公司測序。

1.2.2.4 假單胞菌與轉化子的同源交換。取過夜培養的HYS菌液和鑒定正確的轉化子菌液分別稀釋后等體積混合均勻，滴入LB后放入30 ℃恒溫箱孵育36～48 h，用20%甘油將LB平板上的菌苔洗脫下來記為100，然后進行梯度稀釋至10-6。取后3個稀釋度的菌液涂布慶大霉素和氯霉素雙抗平板，對照做同樣處理培養24 h，從平板上挑單個菌落接種到同樣雙抗的LB液體培養基中，振蕩培養12 h，然后轉接到沒有抗性的LB液體培養基中培養12 h，梯度稀釋菌液至10-6，并取最后3個稀釋度下的菌液涂布5%蔗糖平板，12 h后PCR鑒定單菌落是否為敲除株。

1.2.3 基因的回補菌株及其過表達菌株的構建。

1.2.3.1 回補基因表達質粒的構建。

以HYS為模板，設計引物將目的基因擴增后用Eco RⅠ 和 Xho Ⅰ 雙酶切并回收，再與用相同內切酶處理的質粒載體pBBR1MCS-2進行連接，并通過轉化進入大腸桿菌中，鑒定正確后得到帶有重組表達質粒的菌株。具體操作參照敲除質粒的構建（圖2）。

1.2.3.2 假單胞菌的基因回補。通過接合使重組表達質粒進入已構建好的基因敲除菌株和野生型HYS菌株中，接合時間為12 h，洗脫后，將菌液稀釋至10-4～10-6涂布到有雙抗性（卡那霉素和氯霉素）的篩選平板。同時設置對照組構建帶有質粒載體pBBR1MCS-2的基因敲除菌株和HYS菌株。

2 結果與分析

2.1 目的基因片段克隆 根據HYS基因組上oprD基因上下游序列設計引物，得到與預期大小一致的條帶，上下游均約為350 bp。雙酶切上下游片段和pEX18Gm（5 831 bp）載體，瓊脂糖凝結結果見圖3。

2.2 基因缺失載體的構建 將雙酶切回收后的片段與載體進行三段酶連，所得產物轉大腸桿菌感受態，涂布于抗性平板。所得轉化子5個，以通用引物進行PCR鑒定，所得結果見圖4。只有一個轉化子在800 bp處有條帶與預期相符。測序結果顯示，序列同源性99%以上為陽性克隆。

2.3 HYS同源交換 將HYS菌株與轉化子混合均勻，孵育后洗脫，梯度稀釋后選擇合適的稀釋梯度涂布慶大霉素和氯霉素雙抗平板。將所選擇菌落接種于同樣雙抗的LB液體培養基中12 h，轉接到沒有抗性的LB液體培養基12 h，梯度稀釋后選擇合適稀釋度涂布5%蔗糖平板，以HYS基因組為模板，設計引物對長出的4個菌落PCR進行鑒定，結果表明有一個條帶相符，公司測序結果符合為同源交換陽性株（圖5）。

因質粒pEX18Gm不能在假單胞菌中獨立復制，只可以通過整合后復制。故通過慶大霉素和氯霉素雙抗選擇和無抗選擇，可以得到敲除株與野生株，利用5%蔗糖平板篩選出敲除株。

2.4 目的基因回補菌株的構建

以HYS為模板，設計引物將目的基因擴增（750 bp）后雙酶切，用相同內切酶處理的質粒載體pBBR1MCS-2（5 144 bp）膠回收（圖6），酶連并轉化，鑒定正確后得到帶有重組表達質粒的菌株。測序結果正確，回補載體構建完成。

3 討論該研究所用的假單胞菌，因產鐵載體與其他假單胞菌不同[11，13]，以該細菌喂食線蟲，有明顯的線蟲致死效應。利用轉座子插入突變的方式，多次篩選得到多個毒性相關基因。但目前對這些基因的毒性作用機理卻知之甚少。

在對病原微生物毒性基因的研究過程中[14-15]，目的基因的缺失是確定其功能、闡明毒性機理的重要方法。利用同源重組交換的方式敲除待研究基因是研究其功能的重要手段[16-20]。

利用分子生物學的手段，以同源重組為基礎構建了假單胞菌潛在毒性基因oprD的缺失載體和回補載體。利用氨芐抗性篩選缺失基因轉化子。在同源交換過程中，通過慶大霉素和氯霉素雙抗篩選雙交換敲除株和野生株，最終通過激活蔗糖致死性基因排除野生株，得到敲除株，并以測序的方式驗證其正確性。另外，用類似的方法對目的基因進行回補，為下一步研究oprD基因的毒性功能以及為其他潛在的毒性基因功能研究奠定基礎。

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