壯骨止痛膠囊對去卵巢大鼠體質量及脂/骨代謝的影響

楊珊珊 陳紅瓊 陳瑤 郁潔 羅堅 周薇 彭振 雷曉明

〔摘要〕 目的 探討壯骨止痛膠囊對去卵巢大鼠體質量及脂/骨代謝的影響。方法 選用健康雌性SD大鼠30只，隨機分為空白（Blank）組、假手術（Sham）組、模型（OVX）組、壯骨止痛膠囊（ZGZTC）組和雌激素（EV）組，每組6只。OVX組、ZGZTC組以及EV組均摘除雙側卵巢，Sham組僅在卵巢周圍切除相應體積的脂肪。ZGZTC組（567 mg/kg）、EV組（0.21 mg/kg）灌胃相應藥物，Sham組和OVX組灌胃相應體積生理鹽水，Blank組不做處理。每周檢測體質量，干預12 周后用顯微CT檢測大鼠右股骨骨密度（bone mineral density， BMD），掃描電鏡分析左股骨骨小梁超微結構，HE染色評價脛骨組織微結構的變化，ELISA法測定血清雌激素（estrogen， E2）、脂聯素（adiponectin， ADP）、瘦素（leptin， LEP）、骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase， BALP）、骨鈣素（bone-Gla-protein， BGP）、I型前膠原N端前肽（N-terminal propeptide of type I procollagen， PINP）水平。結果 與Blank組和Sham組比較，OVX組大鼠BMD顯著降低（Ρ<0.001），骨小梁孔隙率增加，骨小梁厚度變薄，間距增大，內部骨微結構紊亂，BALP及ADP水平顯著升高（Ρ<0.05，Ρ<0.01，Ρ<0.001）。與Blank組比較，OVX組大鼠E2水平顯著下降（Ρ<0.05）。與OVX組比較，ZGZTC組大鼠脛骨、股骨骨小梁形態結構改善，骨髓腔內脂肪空泡面積及數目減少（Ρ>0.05），體質量降低（Ρ<0.001），血清E2水平和PINP水平顯著升高（Ρ<0.05）， BALP水平顯著降低（Ρ<0.01）;其血清LEP水平升高，ADP、BGP水平降低，但差異無統計學意義（Ρ>0.05）。結論 壯骨止痛膠囊可能通過調節血清E2、脂肪因子ADP、LEP水平，抑制成脂分化過度，促進成骨分化，減少骨髓脂肪堆積，抑制過度骨代謝，改善骨小梁微結構，防治絕經后骨質疏松癥，并維持體質量穩定，減少骨折的發生。

〔關鍵詞〕 壯骨止痛膠囊;骨質疏松癥;脂骨代謝;骨髓脂肪;掃描電鏡;骨微結構

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.01.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Zhuanggu Zhitong Capsule on body weight and lipid/bone metabolism of ovariectomized rats. Methods 30 healthy female SD rats were randomly divided into Blank group， Sham group， OVX group， ZGZTC group and EV group， with 6 rats in each group. Bilateral ovaries were removed in OVX group， ZGZTC group and EV group， and only the corresponding volume of fat around the ovaries was removed in Sham group. ZGZTC （567 mg/kg） and EV （0.21 mg/kg） groups were intragastricted with corresponding drugs， Sham group and OVX group were intragastricted with corresponding volume of normal saline， Blank group was not treated. The body weight was measured every week. After 12 weeks of intervention， the bone mineral density （BMD） of the rat's right femur was measured by micro-CT， the ultrastructure of the trabecular bone of the left femur was analyzed by scanning electron microscope （SEM）， the changes of tibial tissue microstructure were evaluated by HE staining， ELISA method was used to determine serum estrogen （E2）， adiponectin （ADP）， leptin （LEP）， bone alkaline phosphatase （BALP）， bone-Gla-protein （BGP）， N-terminal propeptide of type I procollagen （PINP） levels. Results Compared with Blank group and Sham group， BMD of rats from OVX group was significantly decreased （Ρ<0.001）， and the porosity of bone trabecular was increased， the thickness was thinner and spacing of bone trabecular increased， the internal bone microstructure was disturbed， and the levels of BALP and ADP were significantly increased （Ρ<0.05，Ρ<0.01，Ρ<0.001）. Compared with Blank group， E2 level of rats from OVX group was significantly decreased （Ρ<0.05）. Compared with OVX group， the morphology and structure of tibia and femur trabecular bone of rats from ZGZTC group were improved， and the area and number of fat cavitation in bone marrow cavity were decreased （Ρ>0.05）， body weight was decreased （Ρ<0.001）， serum E2 and PINP levels were significantly increased （Ρ<0.05）， and BALP level was significantly decreased （Ρ<0.01）， serum LEP level was increased and ADP and BGP levels were decreased， but the differences were not statistically significant （Ρ>0.05）. Conclusion Zhuanggu Zhitong Capsule may inhibit excessive adipogenicdifferentiation， promote osteogenic differentiation， reduce bone marrow fat accumulation， inhibit excessive bone metabolism， improve bone trabecular microstructure， prevent and cure postmenopausal osteoporosis， maintain stable body mass and reduce the occurrence of fractures by regulating serum E2， adipogenic factor ADP and LEP levels.

〔Keywords〕 Zhuanggu Zhitong Capsule; osteoporosis; lipid bone metabolism; bone marrow fat; scanning electron microscope; bone microstructure

骨質疏松癥（osteoporosis， OP）是最常見的骨骼疾病，是一種以骨量低、骨組織微結構破壞導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病，可發生于任何年齡，但多見于絕經后女性和老年男性[1]。骨髓微環境的變化與OP的發生、發展密切相關，骨髓微環境主要由骨髓基質、微血管、成骨細胞（osteoblast，OB）、破骨細胞（osteoclast， OC）、脂肪細胞、造血細胞及相關細胞因子等組成，是骨吸收和骨重建的重要場所[2]。近年來，人們發現骨髓間充質干細胞（bone marrow

mesenchymal stem cells， BMSCs）向OB和脂肪細胞分化紊亂可能是導致OP的重要原因，形成了“骨髓脂肪細胞過剩”導致OP的學說[3]，因而OP也被稱為“骨骼的肥胖癥”[4]。在生理狀態下，OB、成脂細胞平等競爭地從BMSCs分化形成;而在衰老、絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis， PMOP）等狀態下，BMSCs向成脂細胞分化增強，OB分化減弱，從而導致骨髓脂肪堆積、骨量減少等病理性改變[5-6]。PMOP狀態下骨量與骨髓脂肪呈負相關，且骨髓脂肪作為參與調節能量與內分泌功能的組織可直接或間接抑制成骨分化與骨形成，促進破骨分化與骨吸收，從而影響骨代謝[7]。因此，通過改善其成骨-成脂分化的失衡，調節脂/骨代謝紊亂是防治PMOP的有效途徑之一。

壯骨止痛膠囊是湖南省名中醫莫新民教授的經驗方，已獲得國家新藥證書（國藥準字Z20050125），全方由淫羊藿、補骨脂、枸杞子、女貞子、狗脊、骨碎補、懷牛膝7味中藥組成，對PMOP具有良好防治作用。但壯骨止痛膠囊發揮抗OP的作用是否與調節脂/骨代謝有關，尚未見相關報道。因此，本實驗擬觀察壯骨止痛膠囊對去卵巢大鼠體質量及脂/骨代謝的影響，并探討此影響在抗OP中發揮的作用。

1 材料

1.1 ?動物

SPF級雌性SD大鼠30只，7周齡，體質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，飼養于湖南中醫藥大學清潔級動物實驗中心，許可證號：SYXK（湘）2019-0009。溫度（22±2） ℃，濕度（50±10）%，12 h晝夜循環照明，分籠飼養。每日定時清洗籠舍，大鼠能自由攝食及飲水。飼料為標準普通飼料（湖南中醫藥大學動物實驗中心提供），定期更換墊料。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物管理和使用委員會的要求，符合3R原則。

1.2 ?藥品與主要試劑

壯骨止痛膠囊（四川美大康藥業股份有限公司，批號：Z20050118，0.45 g/粒）;戊酸雌二醇（拜耳醫藥保健有限公司，批號：J20171038，1 mg/片）;戊巴比妥鈉（美國默克公司，批號：20200422）;青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：F9102109）;電鏡固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G1102）;雌激素（estrogen， E2，批號：C0317020308）、瘦素（leptin， LEP，批號：Z12036492）、骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase， BALP，批號：Z08036494）、脂聯素（adiponectin， ADP，批號：Z07036493）、骨鈣素（bone-Gla-protein， BGP，批號：Z07036125）、I型前膠原N端前肽（N-terminal propeptide of type I procollagen， PINP，批號：Z11036497）ELISA試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 ?主要儀器

Heraeus Fresco 21型微量冷凍離心機（德國Thermo Fisher科技公司）;991型超低溫冰箱（賽默飛世爾科技有限公司）;MB-530型多功能酶標儀（深圳匯松科技發展有限公司）;HM325型石蠟切片機（賽默飛世爾科技有限公司）;BA410E型顯微鏡（麥克奧迪電氣股份有限公司）;K850型臨界點干燥儀（英國Quorum公司）;MC1000型離子濺射儀（日立公司）;SU8100型掃描電子顯微鏡（日立公司）;Quantum GX型小動物顯微CT（珀金埃爾默股份有限公司）。

2 方法

2.1 ?動物分組及給藥

大鼠適應性喂養7 d后開始試驗，遵循隨機原則，將30只SD大鼠分為空白（Blank）組、假手術（Sham）組、模型（OVX）組、雌激素（EV）組、壯骨止痛膠囊（ZGZTC）組，每組6只。OVX組、EV組、ZGZTC組均摘除雙側卵巢，Sham組僅在卵巢周圍切除相應體積的脂肪。

各組均從術后1周開始給藥，每天灌胃1次，連續12周。給藥量按照70 kg成人與0.2 kg大鼠體表面積等效換算（成人劑量×70 kg×0.018/0.2 kg）。Sham組和OVX組每天灌胃相應體積生理鹽水，ZGZTC組（567 mg/kg）、EV組（0.21 mg/kg）灌胃相應藥物，Blank組不做處理。

2.2 ?PMOP大鼠模型的建立

采用國內外公認的雌性大鼠PMOP模型[8-9]。用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g體質量）麻醉，無菌條件下摘除大鼠雙側卵巢，Sham組僅在卵巢周圍切除相應體積的脂肪，術后連續3 d大腿肌肉注射青霉素鈉，每只大鼠4萬U/d，術后5 d連續觀察大鼠陰道脫落細胞涂片，發現模型大鼠細胞涂片以白細胞為主，提示造模成功[10]。5 d后拆線，每周測量體質量，12周后麻醉，取股骨、脛骨、血清。

2.3 ?顯微CT檢測大鼠股骨骨密度（bone mineral

density， BMD）

應用小動物顯微CT評價大鼠右側股骨遠端的微觀結構。感興趣區域（region of interest， ROI）包括從生長板最高點以下1 mm位置開始往下數40層的骨小梁平掃圖片。對ROI區三維圖像進行定性和定量分析BMD。掃描模式為：掃描電壓90 kV，掃描電流為80 μA，掃描時間為14 min，旋轉角度360°，分辨率為18 μm。掃描完成后采用Analyze 12.0分析。

2.4 ?掃描電鏡觀察股骨骨小梁超微結構

剖取左側完整的股骨，去除上面附著的肌肉組織，保留骨膜，使用0.1%磷酸緩沖液進行清洗后在2.5%戊二醛溶液中進行固定，叔丁醇梯度脫水，-10 ℃冰凍，干燥。導電膠固定標本，噴金，使用掃描電子顯微鏡觀察鈦合金材料表面與孔隙內骨組織及纖維組織生長情況。

2.5 ?HE染色法檢測大鼠脛骨組織微結構變化

剖取左側完整的脛骨，去除上面附著的肌肉組織，保留骨膜，在中性福爾馬林溶液中固定一周，隨后置于EDTA脫鈣液中浸泡兩月，保證液體完全覆蓋樣本，每周更換新的脫鈣液，液體為標本體積的5倍。然后常規脫水，浸蠟，包埋，切片，展片，烤片，染色。通過顯微鏡拍照觀察骨小梁結構，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析處理軟件測定脂肪空泡數目及面積。

2.6 ?ELISA法檢測大鼠血清激素的表達

腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉，腹部切口分離腹主動脈，用負壓采血管采血5 mL，靜置2 h，3000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心15 min后分離血清，使用大鼠特異性試劑盒檢測血清E2、ADP、LEP、BALP、BGP、PINP水平。

2.7 ?統計學處理

數據用“x±s”表示，所有資料進行正態性檢驗。符合正態分布者，多組計量資料采用單因素方差分析，方差齊者用LSD和SNK法，方差不齊者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法;不符合正態分布者，采用多個獨立樣本比較的秩和檢驗（K Independent Samples）。所有數據使用SPSS 25.0軟件進行處理。以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?壯骨止痛膠囊對去卵巢大鼠BMD的影響

與Blank組和Sham組比較，OVX組大鼠BMD顯著降低（P<0.001）;與OVX組比較，ZGZTC組BMD升高，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

3.2 ?壯骨止痛膠囊對去卵巢大鼠體質量的影響

Blank組、Sham組、ZGZTC組、EV組各組間體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05）;與其余各組比較，OVX組體質量顯著升高（P<0.001）。去卵巢手術后第2、3個月，各組體質量增長量均較第1個月有所降低。與Sham組比較，OVX組去卵巢手術后第二個月體質量增長顯著（P<0.05）;與OVX組比較，ZGZTC組及EV組去卵巢手術后第1、2、3個月體質量增長均減少，但差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖2。

3.3 ?壯骨止痛膠囊對去卵巢大鼠骨小梁超微結構的影響

Blank組和Sham組骨小梁相互交織成網狀結構，骨小梁表面被覆的骨膠原纖維排列緊密，其走行方向與骨小梁長軸方向基本一致，骨膠原纖維表面的纖絲排列緊密，呈束狀無分離現象，OVX組骨小梁網狀結構破壞嚴重，骨小梁明顯變細變薄，表面凹凸不平極為粗糙，排列雜亂無章，斷裂、缺失現象嚴重，骨小梁表面骨膠原纖維結構散亂、粗細不等，出現卷曲及斷裂現象，骨膠原纖維間空隙增大，骨膠原纖維的纖絲排列紊亂、粗細不均勻，出現退行性改變。與OVX組比較，ZGZTC組、EV組骨小梁結構明顯增粗增厚，骨膠原纖維排列致密，但尚未恢復至正常。見圖3。

3.4 ?壯骨止痛膠囊對大鼠脛骨組織微結構的影響

Blank組和Sham組脛骨組織結構完整，骨小梁密集，粗細均勻，排列整齊，連接成網狀，骨髓腔較小，骨髓細胞數量豐富，脂肪細胞少;而OVX組骨髓腔明顯變大，骨小梁變細、稀疏，間隙增大，排列紊亂，結構缺失嚴重，髓腔內見大量空泡狀脂肪細胞，脂肪細胞周圍OB、骨細胞等顯著減少;與OVX組比較，ZGZTC組和EV組骨組織形態均有不同程度的改善，骨小梁增多、疏松，空泡狀脂肪細胞減少，OB和骨細胞增多，但結構仍不完整。與Blank組比較，OVX組大鼠脛骨脂肪空泡數目和面積顯著增加（P<0.05），藥物干預后，脂肪空泡數目和面積均減少，但差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4-5。

3.5 ?壯骨止痛膠囊對大鼠血清激素水平的影響

給藥治療12周后，與Sham組及Blank組比較，OVX組大鼠血清BALP（P<0.01或P<0.05）、ADP（P<0.05或P<0.001）水平顯著升高;與Blank組比較，OVX組大鼠血清E2水平顯著降低（P<0.05）;與OVX組比較，各藥物治療組血清E2水平均顯著上升（P<0.05），ZGZTC組血清PINP水平顯著上升（P<0.05），BALP水平顯著下降（P<0.01）;各組間大鼠血清BGP、

LEP表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。

4 討論

體質量對骨折風險的影響是復雜的。與穩定體質量相比，體質量增加或減輕均可能增加骨折發生率，但不同骨折部位的相關性不同[11]。

脂肪、骨轉換和BMD密切相關，是OP的一種診斷方法和潛在的治療靶點[12]。骨髓脂肪細胞數量增加，骨折風險也隨之增高[13-14]。此外，骨骼老化與成骨標志物下降和成脂標志物增加有關[15]。有研究表明，骨髓脂肪細胞的副產物會影響骨髓環境中的其他細胞和骨骼微結構[16]，骨髓脂肪細胞可通過在骨髓中分泌游離脂肪酸顯著增加脂肪毒性[17-18]，這些游離脂肪酸對OB和骨細胞有毒性，從而導致自噬和細胞凋亡[19-20]。當骨髓脂肪中不飽和脂肪酸的比例較低時，BMD降低而骨折患病率增高[21]。研究證實，Louvain大鼠中骨髓脂肪區的OB數和骨細胞數顯著減少[22]，表明在骨髓內脂肪區附近可以影響局部細胞密度，從而影響骨的轉換和結構，體現了骨髓脂肪細胞在OP的病理生理學中的作用。

ADP是至今發現的所有脂肪細胞因子中唯一可以進行負性調節的激素，其與骨代謝息息相關，由骨髓脂肪所產生的ADP能通過自分泌或旁分泌的路徑促進骨形成，而處于血液循環中的ADP則通過內分泌的方式抑制骨形成[23]。LEP是肥胖基因的編碼產物，是一種具有內分泌作用的蛋白，主要由外周白色脂肪組織產生，也可由骨髓中的脂肪組織產生，其對骨代謝的作用具有組織特異性和雙重性，其對骨質的影響既有中樞性抑制成骨，也有外周促進成骨的雙重作用[24]。LEP被脂肪組織合成并釋放進入外周循環，可直接作用在外周的骨組織，促進BMSCs向OB分化，并抑制向脂肪細胞分化[25]。有研究表明，脂代謝影響骨代謝還有可能與高脂導致的抗氧化能力受損相關[26]。氧化脂質能夠促進BMSCs向脂肪細胞分化，同時還能刺激OC生成和誘發炎癥反應導致骨吸收，共同加劇骨的破壞[27]。E2水平降低可引起氧化應激從而導致BMSCs的成脂-成骨分化失衡，其通過誘導核心蛋白β-catenin與FoxO3a和PPARγ的結合，從而抑制骨髓的成骨性分化，使脂肪形成，最終導致OP[28]。

骨形成標志物包括BALP、BGP、PINP等。骨骼礦化受阻時，OB合成大量堿性磷酸酶，使血清BALP明顯升高[29]。應用藥物治療可以使BALP下降，且這種下降通常出現在BMD增加之前，所以BALP是OP治療療效評價的重要指標之一，而BGP是骨基質礦化的必需物質，在調節骨鈣代謝中起重要作用，反映骨代謝的總體水平，血清中BGP水平可直接反映OP患者OB活性和骨形成情況，PINP在血清中的含量則反映OB合成骨膠原的能力，其血液中的含量主要反映Ⅰ型膠原的合成速率和骨轉換的情況，是新骨形成的特異性的敏感指標[30]。

從以上實驗結果分析，去卵巢后大鼠血清E2水平顯著下降，ADP水平顯著升高，LEP水平下降，脂/骨代謝紊亂，成骨-成脂分化失衡，BMSCs向成脂細胞分化增強，OB分化則減弱，從而導致骨髓脂肪細胞數量顯著增加，骨髓脂肪區OB數和骨細胞數相應減少，導致骨量減少，最終造成PMOP。而壯骨止痛膠囊干預后，大鼠血清E2、PINP、LEP水平顯著上升，ADP、BALP水平下降，骨髓脂肪細胞減少，OB數和骨細胞數增多，骨量增多，骨小梁結構改善，表明BMSCs向OB分化增強，成脂細胞分化減弱，成骨-成脂分化失衡的脂骨代謝紊亂情況改善，從而避免了PMOP的發生。因此，通過本次實驗研究可以推測出壯骨止痛膠囊通過上調血清E2、LEP水平和降低ADP水平等促進成骨分化，抑制成脂分化，調節脂/骨代謝紊亂，減少骨髓脂肪堆積，抑制過度骨代謝，使骨量增多，從而改善骨小梁微結構，并維持體質量穩定，以防治PMOP，減少骨折的發生。這是可能的作用機制之一，然而這只是目前從實驗中得出的推斷結論，由于樣本量較小，導致有些指標只呈現出一些變化趨勢，結果差異不顯著，對于壯骨止痛膠囊調節脂/骨代謝防治PMOP的具體機制以及臨床研究，還有待進一步深入探索。

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