維生素C對克氏原螯蝦肝胰腺非特異性免疫的影響

米少輝 尹欣茹 李軍濤 張澤龍 冼健安 王冬梅

摘要：為探究維生素C作為飼料添加劑短期投喂克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）對其肝胰腺非特異性免疫的影響，并尋找出最適的添加量，將規格相同（27g±3g）、健康無傷的克氏原螯蝦暫養7d后分5組，對照組投喂基礎飼料，4個試驗組投喂的飼料為在基礎飼料中添加維生素C（添加量分別：0.1、0.2、0.4、0.8g/kg）。投喂5d后，取試驗蝦肝胰腺進行免疫相關酶活指標的測定，結果顯示：添加0.2g/kg的維生素C可以顯著提升克氏原螯蝦肝胰腺中SOD、CAT、T-AOC等抗氧化酶的活性，對于免疫酶ACP、AKP的活力依然有顯著提升作用。并且對于肝胰腺中MDA的含量有降低作用（P<0.05）。0.4g/kg添加組，能夠顯著提升肝胰腺中CAT活力，并且顯著降低MDA含量（P<0.05）。由此可以得出在飼料中添加0.2～0.4g/kg維生素C可以在一定程度上提升克氏原螯蝦肝胰腺的非特異性免疫。

關鍵詞：維生素C;克氏原螯蝦;非特異性免疫

目前，維生素C作為飼料添加劑[1]，在魚[2-4]、蝦[5-6]、海參[7]、中華鱉[8]均有所研究，在飼料中適當比例的添加維生素C投喂，均已證明適量添加維生素C可以增加水生生物的非特異性免疫以及抗應激能力。但是發現其共同特點是均投喂30d以上，投喂時間較長。添加維生素C飼料短期投喂水生生物，對其非特異性免疫影響的研究較少。因此本試驗旨在探究飼料中添加不同水平的維生素C，投喂5d，對克氏原螯蝦非特異性免疫的影響，進而使維生素C能更大限度地發揮作用，得以應用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用的克氏原螯蝦（平均體重27.0g±3.0g）來源為海南歸耕田農業科技有限公司。試驗用水族箱大小為60cm×43cm×36cm。試驗用維生素C由海口藍海中漁生物科技有限公司提供。

1.2試驗飼料

試驗所用基礎飼料為蝦料專用配合飼料（粗蛋白≥28.0%，粗脂肪≥3.0%，粗纖維≤10.0%，粗灰分≤18.0，0.6%≤總磷≤1.4%，鈣0.5～5.0，水分≤12.5%）。試驗組飼料為在基礎飼料中分別添加0.1、0.2、0.4、0.8g/kg的維生素C。

1.3試驗儀器

超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、微量丙二醛（MDA）測定試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、酸性磷酸酶（ACP）測定試劑盒、堿性磷酸酶（AKP）測定試劑盒、蛋白定量（TP）測定試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。生理鹽水（已提前配制）。

臺式高速冷凍微量離心機、全波長酶標儀、可見紫外分光光度計、數顯恒溫水浴鍋、多樣品組織研磨機、電子天平、2.5mL無菌注射器、1mL無菌注射器（江西三鑫醫療科技有限公司生產）、1.5mLAxygen離心管、高壓滅菌鍋、增氧機、移液槍等。

1.4飼養管理

將購買的克氏原螯蝦在大小為60cm×43cm×36cm，水深15cm的水族箱暫養7d后，挑選健康強壯、規格一致的克氏原螯蝦，共分為5組（編號A—E），每組3個重復，每個重復在試驗箱中養殖克氏原螯蝦15尾。A組為對照組，投喂基礎飼料，各試驗組飼料中維生素C添加量分別為：B組0.1g/kg，C組0.2g/kg，D組0.4g/kg，E組0.8g/kg。養殖期間水溫為23～26℃。在水族箱中增加適量的遮蔽物，防止試驗期間成蝦自相殘殺。試驗用水為曝氣的自來水，水體pH值控制在7.5左右。養殖期間均充氣養殖，除投喂飼料有區別外，其他變量保持一致。每天早晚投喂兩次且以晚上投喂量為主，投喂量為成蝦體重的3%～5%，各組間投喂量保持一致，具體以實際吃食情況為準。暫養結束后開始投喂試驗，在投喂5d后，在3個平行的箱子各取3尾克氏原螯蝦，取其肝胰腺進行酶活等生理生化指標檢測。

1.5樣品的采集與制備

解剖螯蝦，取適量肝胰腺，用0.85%氯化鈉生理鹽水清洗去除污物，用濾紙吸干水分后置于離心管中放入液氮快速冷凍，然后轉入-80℃冰箱保存，備用。

1.6相關免疫酶活性指標測定

超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛含量（MDA）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）按照試劑盒的說明進行檢測。

1.7數據分析

用Excel2019求得試驗數據的平均值以及標準差，利用軟件SPSSStatistics18.0進行單因素方差分析（one-wayANOVA）和Duncan多重比較，試驗結果以平均值±標準誤（Mean±SD）表示，（P<0.05）為差異性顯著。

2結果與分析

2.1飼料中維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺SOD活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中SOD活力呈現出先升高后降低的趨勢，其中在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強克氏原螯蝦肝胰腺SOD活力（P<0.05），其他各維生素C添加組與對照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖1。

柱上標不同字母表示差異顯著（P<0.05），相同字母表示差異不顯著（P>0.05），下同。

2.2飼料中維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺MDA含量的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中MDA含量呈現出先降低后升高的趨勢，其中在飼料中添加0.2、0.4g/kg維生素C能夠顯著降低克氏原螯蝦肝胰腺中MDA的含量（P<0.05），其他各維生素C添加組與對照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖2。

2.3飼料中維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺CAT活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中CAT活力呈現出先升高后降低的趨勢，其中在飼料中添加0.2、0.4g/kg維生素C能夠顯著增強克氏原螯蝦肝胰腺CAT活力（P<0.05）。0.2g/kg添加組肝胰腺CAT活力最高，顯著高于其他試驗組和對照組（P<0.05）。除0.2、0.4g/kg添加量外，其他各維生素C添加組與對照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖3。

2.4飼料中維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺AKP活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中AKP活力變化趨勢為隨著維生素C添加量的增加，AKP活力先升高后降低，當在飼料中添加0.2g/kg維生素C時，肝胰腺中的AKP活力最高，并且顯著高于對照組，可見，在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強克氏原螯蝦肝胰腺AKP活力（P<0.05）。除0.2g/kg添加組外，其他各維生素C添加組與對照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖4。

2.5飼料中維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺ACP活力的影響

隨著飼料中維生素C添加量的增加，克氏原螯蝦肝胰腺中ACP活力變化趨勢為隨著維生素C添加量的增加，ACP活力先升高后降低，當在飼料中添加0.2g/kg維生素C時，肝胰腺中的ACP活力最高，并且顯著高于對照組，可見，在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強克氏原螯蝦肝胰腺ACP活力（P<0.05）。除0.2g/kg添加組外，其他各維生素C添加組與對照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖5。

2.6飼料中維生素C添加量對克氏原螯蝦肝胰腺T-AOC變化的影響

克氏原螯蝦肝胰腺中的總抗氧化能力，隨著飼料中維生素C添加量的增加，呈現出先升高后降低的趨勢，其中肝胰腺T-AOC在維生素C添加量為0.2g/kg時最優，當在飼料中添加0.2g/kg維生素C時，肝胰腺中的T-AOC顯著高于對照組，可見，在飼料中添加0.2g/kg維生素C能夠顯著增強克氏原螯蝦肝胰腺T-AOC（P<0.05）。除0.2g/kg添加組外，其他各維生素C添加組與對照組相比均不存在明顯差異（P>0.05）。見圖6。

3討論

SOD和CAT是生物體內抗氧化指標的指示酶，在機體內主要參與機體內自由基的清除，從而維持機體內自由基的動態平衡[9]。MDA是自由基引起脂質過氧化所產生的產物，其含量的高低可以間接反應機體自由基的含量以及脂質的過氧化程度[10]。T-AOC反應抗氧化系統整體水平，主要抑制過氧化鏈產生，達到消除自由基的效應[11]。AKP和ACP是生物體內巨噬細胞溶酶體的標志酶，主要參與磷酸基團的轉移和代謝，在免疫系統中也發揮著重要作用，同樣可以間接反應機體的免疫能力[12]。另外，甲殼動物氧化代謝的主要場所為肝胰腺而非血清[13]，所以本試驗主要研究維生素C添加對肝胰腺中免疫指標的影響。

有研究表明維生素作為飼料添加劑的應用具有增強蝦類免疫力以及抗氧化能力的重要作用，并降低機體的應激性，增加對外界環境因子劇烈變化的抵抗能力[14]。王偉慶等[15]研究發現，在中國對蝦的飼料中添加適量的維生素C衍生物維生素C多聚磷酸酯（LAPP），能夠提高其抵抗副溶血弧菌的能力，提高其機體的免疫性能。另外，LAPP的添加提高了中國對蝦血細胞吞噬金黃色葡萄球菌的能力，表明其對細菌感染的抗病性得到提高。宋理平等[16]的研究表明，維生素C能夠增加中國明對蝦（Penaeuschinensis）幼體的免疫力。維生素C和β-葡聚糖協同使用，使對蝦幼體對于哈維氏弧菌的抵抗力增強，同時增強了免疫酶的活性以及提高了免疫保護率。王文婧等[17]研究發現，大劑量投喂維生素C能夠提高凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）肝胰腺溶菌酶（LZM）和酸性磷酸酶（ACP）的活性，對于輕度擁擠脅迫造成的凡納濱對蝦免疫機能的變化有一定的緩沖作用，但是不能消除脅迫對其所造成的影響。Kong等[18]研究發現，在克氏原螯蝦日糧中添加250.12mg/kg和321.38mg/kgVc均能提升克氏原螯蝦的非特異性免疫。上述研究與本試驗結果相一致。

4結論

在本試驗中，添加0.2g/kg的維生素C可以顯著提升克氏原螯蝦肝胰腺中SOD、CAT、T-AOC等抗氧化酶的活性，對于免疫酶ACP、AKP的活力有顯著提升作用，并且對于肝胰腺中MDA的含量有降低作用。0.4g/kg添加組，能夠顯著提升肝胰腺中CAT活力，并且顯著降低MDA含量。由此可以得出，在飼料中添加0.2～0.4g/kg維生素C可以在一定程度上提升克氏原螯蝦肝胰腺的非特異性免疫。

參考文獻：

[1]王孝忠.水產餌料添加劑——世界最新型高穩定性維生素C源LAPP研制成功[J].飼料研究，1991（2）：31.

[2]王貞杰，葉保民，常青，等.飼料維生素C含量對圓斑星鰈幼魚抗氨氮脅迫能力的影響[J].動物營養學報，2016，28（12）：4054-4062.

[3]韋海明.黃芪和維生素C對大黃魚抗應激的影響[D].青島：中國海洋大學，2014.

[4]明建華.大黃素和維生素C對團頭魴生長、非特異性免疫以及抗應激的影響[D].南京：南京農業大學，2011.

[5]陳亞坤.Vc對擁擠脅迫下南美白對蝦免疫機能的影響[D].保定：河北農業大學，2011.

[6]田立立.飼料中添加維生素C對克氏原螯蝦生長和高pH脅迫的影響[D].揚州：揚州大學，2021.

[7]王晶.維生素C對刺參（Apostichopusjaponicus）鎘中毒的緩解作用研究[D].大連：大連海洋大學，2016.

[8]聶月美.飼料維生素C對中華鱉免疫、抗應激和體組成的影響[D].杭州：浙江大學，2006.

[9]趙紅霞，陳啟明，黃燕華，等.飼料精氨酸水平對黃顙魚幼魚生長性能、消化吸收相關指標、免疫功能和抗氧化能力的影響[J].動物營養學報，2018，30（12）：5040-5051.

[10]陳科全，葉元土，蔡春芳，等.飼料丙二醛對草魚生長、肝胰臟及腸道結構和功能的影響[J].水生生物學報，2016，40（4）：779-792.

[11]翟少偉，史慶超，陳學豪.飼料中添加抗菌肽Surfactin對吉富羅非魚腸道健康的影響[J].水生生物學報，2016，40（4）：823-829.

[12]朱旭楓，黃洋，黃俊杭，等.水解單寧對珍珠龍膽石斑魚生長性能、抗氧化能力、腸道組織結構與菌群多樣性的影響[J].動物營養學報，2021，33（2）：1020-1035.

[13]王麗，韓艷楠，金珊，等.水體Cu2+對三疣梭子蟹主要組織ROS含量和抗氧化能力的影響[J].農業環境科學學報，2015，34（7）：1261-1268.

[14]趙文.維生素C與水產養殖[J].飼料博覽，1995（5）：35-38.

[15]王偉慶，李愛杰.LAPP對中國對蝦（Penaeuschinensis）生長，缺氧耐受力免疫抵抗力的影響[J].海洋湖沼通報，1996（1）：42-49.

[16]宋理平，周洪琪，黃旭雄，等.Vc及其與β-葡聚糖混合物對中國明對蝦生長和免疫功能的影響[J].飼料工業，2006，27（4）：35-39.

[17]王文婧，郭冉，夏輝，等.大劑量維生素C對擁擠脅迫下凡納濱對蝦免疫因子的影響[J].江蘇農業科學，2012，40（5）：202-206.

[18]KONGFS，ZHUYH，YUHJ，etal.EffectofdietaryvitaminConthegrowthperformance，nonspecificimmunityandantioxidantabilityofredswampcrayfish（Procambarusclarkii）[J].Aquaculture，2021，541：736785.

（收稿日期：2021-09-30;修回日期：2021-12-16）