安石榴苷對阿霉素所致心臟毒性的改善作用及其可能機制▲

安慧仙 孫 闖 李 煒 康曉軍 方 東 高 釗 王 瑞 曾廣偉

(西安國際醫學中心醫院心血管內科，陜西省西安市 710100)

阿霉素是臨床廣泛使用的一線抗癌藥物，在淋巴血液系統惡性腫瘤(如淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和白血病等)和實體器官惡性腫瘤(如甲狀腺癌、乳腺癌、骨肉瘤、肉瘤等)中均有較好的治療效果，但劑量依賴性的心臟毒性限制了阿霉素的臨床應用[1-3]。目前，阿霉素導致心臟毒性的機制尚未完全闡明，已知的機制主要包括活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)增加、拓撲異構酶介導的DNA修復受阻、線粒體結構破壞等[4-5]。

安石榴苷是石榴皮多酚的主要活性物質，具有多種藥理學特性，包括抗炎、抗病毒、抗氧化作用等[6-7]。以往的研究已經證實，安石榴苷可改善多種疾病的癥狀，如阿爾茲海默癥、腫瘤和心血管疾病等[8-9]。還有研究表明，安石榴苷可通過抗氧化作用減輕腦缺血再灌注損傷和心臟缺血再灌注損傷[10-11]。然而安石榴苷是否可以改善阿霉素誘發的心臟毒性，其相關機制如何，目前尚未清楚。因此，本研究通過建立阿霉素誘發的心臟毒性小鼠模型，探討安石榴苷能否通過調控5′-單磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase,AMPK)/核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路改善阿霉素誘發的心臟毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 48只8周齡成年雄性C57BL/6小鼠購于西安交通大學實驗動物中心[動物生產許可證：SCXK(陜)2018-001]，體質量25～30 g。將小鼠飼養于溫度為(25±1)℃，相對濕度為(55±5)%，12 h/12 h明暗交替的動物房。阿霉素(批號：D1515)、安石榴苷(批號：P0023)和Compound c(一種AMPK抑制劑；批號：171260)購于Sigma-Aldrich Lab & Production Materials公司；二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)染色試劑盒(批號：E004-1-1)和肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT；批號：H149-4)試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司；cleaved Caspase-3(批號：9661)、細胞色素c(cytochrome c，Cyt-c；批號：11940)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK；批號：2537)、AMPK(批號：5832)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2；批號：13141)、Nrf2(批號：12721)和血紅素加氧酶 1(heme oxygenase 1，HO-1；批號：82206)抗體均購于Cell Signaling Technology公司；gp91phox(還原型輔酶Ⅱ氧化酶2的亞基；批號：19013-1-AP)抗體購買于武漢三鷹生物技術有限公司；GAPDH抗體(批號：TA-08)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(批號：ZB-5305)和山羊抗兔抗體(批號：ZB-2301)購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗分組和動物模型的建立 48只C57BL/6小鼠在動物房內適應性喂養3 d后用于實驗。將小鼠按隨機數字表法分為對照組、阿霉素組、阿霉素+安石榴苷組、阿霉素+安石榴苷+Compound c組，每組12只。除對照組外，給予其他各組小鼠一次性腹腔注射阿霉素(15 mg/kg)。同時，給予阿霉素+安石榴苷組小鼠腹腔注射安石榴苷(30 mg/kg，1次/d)，給予阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠腹腔注射安石榴苷(30 mg/kg，1次/d)后再腹腔注射Compound c(0.25 mg/kg，1次/d)，均連續干預7 d。實驗干預期間給予對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。本實驗模型建立的方法和藥物注射濃度均參照相關文獻[11-13]。

1.3 觀察指標

1.3.1 心臟功能：干預7 d后，用4 %水合氯醛麻醉小鼠后將其固定在恒溫手術臺上，在體視顯微鏡下辨別、分離頸動脈，于頸動脈遠端穿線結扎，在頸動脈近端做一切口，將連有壓力傳感器的動脈套管針沿切口經頸動脈插入左心室，采用多道生理記錄儀[埃德儀器國際貿易(上海)有限公司，型號：Labchart 8]測量左室壓力上升最大速率(+dp/dtmax)和左室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)，以評估各組小鼠心臟的收縮和舒張功能。

1.3.2 心臟組織形態結構：檢測心臟功能后，行頸動脈血管分離術并于剪口取血1 mL；4 ℃下3 000 r/min離心10 min，獲取上清液，并凍存于-80 ℃冰箱中備用。然后開胸分離心臟，用預冷的PBS沖洗以去除血液，然后將部分心臟組織放入4 %多聚甲醛中室溫固定48 h；常規石蠟包埋、制作切片；將石蠟切片在二甲苯和梯度酒精中脫蠟復水后，再行HE染色，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察各組小鼠的心臟組織形態結構。

1.3.3 血清cTnT水平：取1.3.2的上清液，嚴格按照試劑盒說明書，采用ELISA檢測，于酶標儀上檢測450 nm波長處各組吸光度值，然后根據說明書的公式計算出各組小鼠血清cTnT水平。

1.3.4 心臟組織ROS水平：采用DHE染色方法檢測ROS水平。取1.3.2經預冷PBS沖洗后的部分心臟組織，用冰凍切片包埋劑快速包埋后制作切片。用PBS將DHE原液按1 ∶1 000配制成工作液，避光37 ℃孵育30 min，然后用PBS漂洗3次，用激光共聚焦顯微鏡掃描拍照，再用Image-Pro Plus軟件測定熒光強度。

1.3.5 cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox、SOD2、p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表達水平：按1.3.2的方法獲取心臟組織后，稱取各組小鼠心臟組織50 mg，加入含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和RIPA的裂解混合液，低溫下研磨20 min，4 ℃下15 000 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA法對蛋白進行定量；上樣蛋白后進行SDS-PAGE、轉PVDF膜，采用5 %脫脂奶粉封膜2 h，將目的蛋白條帶放入含相應抗體的管中，包括cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox、SOD2、p-AMPK、AMPK、Nrf2、HO-1，稀釋比均為1 ∶1 000，以GAPDH為內參蛋白，稀釋比為1 ∶5 000，于4 ℃下孵育12 h；采用TBST快速洗膜3次，10 min/次，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)孵育膜2 h，TBST快速洗膜3次，10 min/次；于Bio-Rad化學發光儀上顯影，用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學分析 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 4組小鼠心臟功能和血清cTnT水平的比較 與對照組比較，阿霉素組小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)；與阿霉素組比較，阿霉素+安石榴苷組小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax增加，血清cTnT水平降低(均P<0.05)；與阿霉素+安石榴苷組比較，阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)。見表1。

表1 4組小鼠心臟功能和血清cTnT水平的比較(x±s)

2.2 4組小鼠心臟形態結構的比較 HE染色結果顯示，對照組小鼠心肌纖維排列整齊，胞質無空泡化現象；阿霉素組小鼠心肌纖維排列不整齊，出現明顯的胞質空泡化；阿霉素+安石榴苷組小鼠心肌纖維排列較為整齊，胞質空泡化現象明顯減少；與阿霉素+安石榴苷組比較，阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠心肌纖維排列不整齊，胞質空泡化現象明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠心臟組織形態結構(HE染色，×200)

2.3 4組小鼠心臟組織凋亡蛋白表達水平的比較 與對照組相比，阿霉素組和阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠的cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表達水平升高(均P<0.05)；與阿霉素組比較，阿霉素+安石榴苷組小鼠的cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表達水平降低(均P<0.05)；與阿霉素+安石榴苷組比較，阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠的cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表達水平升高(均P<0.05)。見圖2和表2。

圖2 各組小鼠cleaved Caspase-3和Cyt-c的蛋白表達情況

表2 各組小鼠心肌細胞凋亡蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.4 4組小鼠心臟組織氧化應激水平的比較 DHE染色和Western blot結果顯示，與對照組比較，阿霉素組和阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠的ROS水平和gp91phox蛋白表達水平升高，SOD2蛋白表達水平降低(均P<0.05)；與阿霉素組比較，阿霉素+安石榴苷組小鼠的ROS水平和gp91phox蛋白表達水平降低，SOD2蛋白表達水平升高(均P<0.05)；與阿霉素+安石榴苷組比較，阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠的ROS水平和gp91phox蛋白表達水平升高，SOD2蛋白表達水平降低(均P<0.05)。見圖3、圖4和表3。

圖3 4組小鼠心臟組織DHE染色結果(×200)

圖4 4組小鼠心臟組織氧化應激蛋白表達情況

表3 4組小鼠心臟組織氧化應激指標水平的比較(x±s)

2.5 各組小鼠心臟組織AMPK/Nrf2通路相關蛋白表達水平的比較 與對照組比較，阿霉素組和阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表達水平降低(均P<0.05)；與阿霉素組比較，阿霉素+安石榴苷組小鼠的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表達水平升高(均P<0.05)；與阿霉素+安石榴苷組比較，阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表達水平降低(均P<0.05)。4組小鼠AMPK蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5和表4。

圖5 各組小鼠心臟組織p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表達情況

表4 4組小鼠心臟組織p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

隨著惡性腫瘤篩查和治療技術的進步，惡性腫瘤患者的預后得到了顯著改善，蒽環類化療藥物在多種惡性腫瘤的治療中發揮重要作用。然而，在接受蒽環類藥物(如阿霉素)治療的成年惡性腫瘤患者中，約有9%的患者會出現心臟毒性，并呈劑量和時間依賴性[14]，這可導致患者的預后不佳，并使得惡性腫瘤幸存者心血管疾病患病率和病死率升高。盡管有關蒽環類藥物心臟毒性機制的研究已開展50年，但具體機制還未完全闡明。

安石榴苷是我國傳統中藥材石榴皮的重要活性成分之一，在線粒體代謝、氧化應激和炎癥反應中發揮重要作用，已經成為臨床上治療多種疾病的潛在選擇。例如，有研究表明，安石榴苷可通過減輕氧化應激和減少細胞凋亡，改善人胎盤滋養層細胞損傷[15]；安石榴苷還可通過抑制心肌細胞凋亡，減輕缺血/再灌注誘導的心肌損傷[11]。但安石榴苷在阿霉素引起的心臟毒性中的作用如何，目前研究報告較少，具體機制還未完全闡明。本研究建立阿霉素誘發的心臟毒性小鼠模型，并給予安石榴苷干預，分析安石榴苷改善阿霉素所致心臟毒性的作用及機制。

cTnT是評估急性冠脈綜合征患者病情的重要指標，而在采用蒽環類藥物化療的不同類型癌癥患者中，有21%～40%的患者出現cTnT持續升高，因此cTnT也可作為識別抗腫瘤藥物所致心臟毒性的早期生物學標志物[16]。此外，蒽環類藥物還可導致心臟功能障礙和心肌纖維損傷[15]。本研究結果顯示，與對照組比較，阿霉素組小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)，心肌細胞胞質呈嚴重空泡化，這提示阿霉素對小鼠產生嚴重的心臟毒性；而給予安石榴苷干預后小鼠的+dp/dtmax和-dp/dtmax升高，血清cTnT水平降低(均P<0.05)，心肌細胞胞質空泡化減輕，提示安石榴苷可以改善阿霉素所致的心臟毒性。與阿霉素+安石榴苷組比較，阿霉素+安石榴苷+Compound c組的小鼠+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，血清cTnT水平升高(均P<0.05)，說明AMPK抑制劑Compound c能逆轉安石榴苷對阿霉素所致心臟毒性的保護作用。

細胞凋亡和氧化應激損傷是阿霉素引起心臟毒性的主要原因之一[2]。當線粒體膜通透性增加，促凋亡因子Cyt-c由線粒體釋放到胞質并與凋亡蛋白酶激活因子結合形成凋亡復合體，將Caspase-3剪切成cleaved Caspase-3，啟動Caspase級聯反應，這是細胞凋亡的主要途徑[17]。氧化因子ROS、gp91phox和抗氧化因子SOD2失衡是機體出現氧化應激的主要原因[18]。有研究顯示，安石榴苷具有較強的抗凋亡、清除自由基和抗脂質過氧化能力[15]。本研究結果顯示，與對照組比較，阿霉素組ROS水平及cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox蛋白表達水平升高，SOD2蛋白表達水平降低(均P<0.05)，說明阿霉素可增強心肌細胞凋亡和氧化應激損傷；而給予安石榴苷干預后，小鼠的ROS水平及cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox蛋白表達水平降低，SOD2蛋白表達水平升高(均P<0.05)，說明安石榴苷可以減輕阿霉素所致心肌細胞凋亡和氧化應激損傷。但與阿霉素+安石榴苷組比較，阿霉素+安石榴苷+Compound c組小鼠ROS水平及cleaved Caspase-3、Cyt-c、gp91phox蛋白表達水平升高，SOD2蛋白表達水平降低(均P<0.05)，提示Compound c能逆轉安石榴苷對阿霉素所致心肌細胞凋亡和氧化應激損傷的改善作用。

AMPK是心肌細胞中調控能量代謝的重要信號分子，Nrf2和HO-1是調控氧化應激損傷的重要信號。細胞能量生成不足可導致單磷酸腺苷/三磷酸腺苷比值增加，AMPK發生磷酸化并被激活，從而促進下游多種靶蛋白參與細胞能量代謝、調控線粒體功能和細胞凋亡等過程[11]。機體出現心臟毒性時，p-AMPK、Nrf2和HO-1表達水平降低，導致線粒體能量代謝障礙、氧化應激增強及細胞凋亡增加[19]。本研究結果顯示，4組小鼠心臟組織中AMPK蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，但阿霉素組小鼠心臟組織中的p-AMPK、Nrf2和HO-1蛋白表達水平較對照組降低，而阿霉素+安石榴苷組p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白表達水平較阿霉素組增加(均P<0.05)，這提示安石榴苷可通過調控AMPK/Nrf2通路，減輕阿霉素引起的小鼠心臟毒性。給予Compound c干預后，其可逆轉安石榴苷對p-AMPK、Nrf2和HO-1表達的調控作用。

綜上所述，阿霉素具有心臟毒性，安石榴苷可能通過調控AMPK/Nrf2通路抑制細胞凋亡和減輕氧化應激損傷，從而改善阿霉素引起的心臟毒性。這或為采用安石榴苷防治阿霉素引起的心臟毒性提供了新思路。