血清外泌體miR-17-92a表達水平與行結直腸癌根治術中注射5-氟尿嘧啶治療的結直腸癌患者預后的關系

唐 斌 丁 俊 蔣葉平 周聯明

(1 上海交通大學附屬第六人民醫院南院普外科，上海市 201499；2 上海市奉賢區奉城醫院普外科，上海市 201499)

結直腸癌是臨床上較為常見的消化系統惡性腫瘤，近年來，我國結直腸癌的發病率呈逐年升高趨勢[1-2]。目前臨床上治療結直腸癌主要以根治性手術為主，患者術后轉移和復發是影響治療效果的關鍵，也是導致患者死亡的主要原因之一[3]。有研究表明，結直腸癌患者術后復發與手術過程中癌細胞未被完全清除有關，手術中采用抗腫瘤藥物干預可有效改善患者的預后[4]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物，手術中將5-Fu直接注射在淋巴結、瘤床、癌細胞易脫落種植部位及血管周圍等處，可起到抑制腫瘤術后轉移、延緩病情復發的作用。miR-17-92a是體內重要的miRNA，其在多種腫瘤患者血清中呈現異常高表達，但miR-17-92a與結直腸癌的關系仍有待進一步研究。因此，本研究探討了血清外泌體miR-17-92a表達水平與結直腸癌根治術中注射5-Fu的結直腸癌患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月至2018年1月期間，在上海交通大學附屬第六人民醫院南院行腹腔鏡下行結直腸癌根治術治療的93例患者作為觀察組，其中男性52例、女性41例，年齡37～65(57.91±7.28)歲；腫瘤分化程度為低分化48例、高分化45例。納入標準：(1)符合《中國結直腸癌診療規范(2015年版)》[5]中相關診斷標準；(2)均經病理學檢查確診；(3)患者意識清晰，可正常配合交流溝通；(4)年齡18～65歲；(5)本次治療前未接受過其他治療；(6)知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)存在手術禁忌證者；(2)腫瘤下緣距肛緣5 cm以內者；(3)對5-Fu過敏者；(4)合并嚴重心、腎、肝臟器疾病者；(5)合并其他腫瘤者；(6)臨床資料或隨訪資料缺失者。選擇同期在上海交通大學附屬第六人民醫院南院進行體檢的50例健康體檢者作為對照組，其中男性26例、女性24例，年齡36～65(55.12±8.89)歲。納入標準：(1)意識清晰，可正常交流溝通；(2)年齡18～65歲；(3)知情同意并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他嚴重器質性疾病或腫瘤者；(2)臨床資料缺失。兩組研究對象的性別、年齡比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經上海交通大學附屬第六人民醫院醫學倫理委員會審議并批準。

1.2 治療方法 所有觀察組患者均采用腹腔鏡下結直腸癌根治術+5-Fu方案治療：采用全身麻醉，嚴格遵照《普通外科腹腔鏡手術操作規范與指南》[6]中相關標準進行手術操作，手術中切除腫瘤近端腸管10～15 cm，遠端腸管2.5 cm以上，并徹底清掃淋巴結，根據TNM原則切除直腸系膜，取標本送至病理科進行病理檢查。然后使用生理鹽水沖洗腹腔，取600 mg 5-Fu緩釋劑(蕪湖先聲中人藥業有限公司，批號：H20030345)，在鄰近的正常組織器官表面注射150 mg，腸系膜血管根部注射250 mg，腫瘤剝離表面注射200 mg，之后進行常規關腹。術后均給予患者抗生素預防感染及營養支持治療。

1.3 資料收集 收集患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤病理類型、腫瘤浸潤深度、遠處轉移、淋巴結轉移等資料。術后隨訪3年，記錄患者的術后生存期。

1.4 外泌體miR-17-92a提取與檢測 采集觀察組患者術前空腹靜脈血5 mL，采集對照組研究對象體檢時空腹靜脈血5 mL，室溫下以2 500 r/min離心10 min后收集血清，采用0.22 μm濾膜過濾，取0.5 mL血清至30 kDa超濾管， 4℃下以10 000 r/min離心30 min濾至剩余100 μL，采用杜氏磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，5 min/次，收集截留物并采用透射電鏡觀察提取物中的外泌體。取外泌體樣品50 μL，使用TRIzol試劑提取總RNA，使用分光光度計檢測RNA濃度及純度，采用TaqMan microRNA反轉錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：MT0006)將RNA反轉錄合成cDNA，然后采用實時熒光定量PCR檢測兩組血清外泌體中miR-17-92a的相對表達水平(miR-17-92a正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGACTGCAGTGAAGGCAC-3′，反向引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內參U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)。PCR反應總體系共20 μL，正向和反向引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL，cDNA 2.0 μL。反應條件為：95 ℃預變性10 s；95 ℃變性5 s，66 ℃退火15 s，52 ℃延伸5 s，重復循環45次。以對照組的miR-17-92a/U6比值平均值的1.25倍作為標準，大于此數值即為miR-17-92a陽性表達。

1.5 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。計數資料采用例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用(x±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制不同miR-17-92a表達情況患者的生存曲線。以P<0.05為差異存在統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象血清外泌體miR-17-92a表達水平的比較 觀察組血清外泌體的miR-17-92a表達水平為3.27±0.84，高于對照組的0.87±0.22(t=25.948，P<0.001)。

2.2 不同臨床病理特征結直腸癌患者血清外泌體miR-17-92a表達水平的比較 不同年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度的結直腸癌患者血清外泌體的miR-17-92a表達水平比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)；相比于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、無遠處轉移的結直腸癌患者，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期及存在淋巴結轉移、遠處轉移的患者的血清外泌體miR-17-92a表達水平更高(均P<0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征結直腸癌患者血清外泌體miR-17-92a相對表達水平的比較

2.3 不同miR-17-92a水平患者的生存期比較 本研究中，觀察組患者血清外泌體miR-17-92a表達陽性66例、陰性27例；血清外泌體miR-17-92a表達陽性的結直腸癌患者術后中位生存時間為31.2個月，血清外泌體miR-17-92a表達陰性的結直腸癌患者術后中位生存時間為33.7個月，血清外泌體miR-17-92a表達陽性的結直腸癌患者術后中位生存時間短于表達陰性者(χ2=12.384，P<0.05)。見圖1。

圖1 不同miR-17-92a表達水平患者的生存曲線

3 討 論

腹腔鏡下腫瘤根治術是目前臨床上治療結直腸癌的主要方法，該治療方法具有療效確切，可有效阻滯病情進展的優點[7]。但也有學者指出，結直腸癌患者在接受腹腔鏡手術治療過程中存在遺漏微小轉移病灶的缺點，在手術過程中亦可出現腫瘤細胞異常脫落并在其他部位定植的情況，導致術后復發和轉移[8]。有學者在手術期內對患者采用化療方案干預，發現這一方案可顯著改善患者的預后，在術后腹膜播散高危患者中具有極高的臨床應用價值[9]。

5-Fu緩釋劑是近年來臨床中應用廣泛的抗腫瘤類藥物，其可抑制脫氧胸甘酸合成酶活性，干擾蛋白質、RNA的合成[10]。5-Fu緩釋劑是化療藥物氟尿嘧啶經高分子聚合物包裹而成的，注射5-Fu緩釋劑后，體液逐漸滲入藥粒，使微囊間的藥物釋放速度得到控制，在注射區域內實現藥物的持續釋放和濃度累積[11]。有學者發現，在腫瘤周圍注射5-Fu緩釋劑可使5-Fu持續、緩慢、恒速、穩定、均勻地釋放，對體內腫瘤細胞起到高效的殺滅作用[12]。研究表明，胃癌和乳腺癌患者采用5-Fu緩釋劑治療可降低腹腔相關并發癥的發生率，且藥物的毒副作用輕，臨床治療效果更好[13]。

外泌體是細胞外小囊泡，由肽、脂質、蛋白質、碳水化合物、核酸等組成，其直徑在30～100 nm左右，屬于細胞外細胞器，含有大量細胞生物分子，對細胞的分化、增殖、免疫反應和死亡起到重要作用[14]。有研究表明，精液、唾液、尿液、血液、膽汁和母乳等多數體液中均可含有外泌體[15]。miRNA屬于經典的非編碼RNA，非編碼RNA不具有蛋白質編碼功能，但在多種癌癥的發生和發展過程中，miRNA表達明顯異常，提示其與腫瘤的發生和發展密切相關[16]。miRNA近年來已成為腫瘤的研究熱點，其可作為評估和治療結直腸癌的重要靶標[17]。有學者發現，在胃癌患者血清中miR-17-92a呈異常高表達，其表達水平與腫瘤TNM分期及分化程度密切相關[18]。還有研究表明，胃癌患者總體生存率與miR-17-92a高表達呈顯著相關，miR-17-92a可作為評估胃癌患者預后質量、病理進展及化療效果的生物學指標[19]。本研究結果顯示，結直腸癌患者血清外泌體的miR-17-92a表達水平高于健康對照人群(P<0.05)。進一步分析發現，相比于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、無遠處轉移的結直腸癌患者，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、存在淋巴結轉移、遠處轉移的患者的血清外泌體miR-17-92a表達水平更高(均P<0.05)，且血清外泌體miR-17-92a表達陽性的結直腸癌患者術后中位生存期短于表達陰性者(P<0.05)。以上結果表明血清外泌體miR-17-92a異常升高與結直腸癌患者接受結直腸癌根治術聯合術中注射5-Fu治療后的預后相關。

綜上所述，結直腸癌患者血清外泌體miR-17-92a mRNA表達水平異常升高，血清外泌體miR-17-92a表達陽性的患者接受結直腸癌根治術聯合術中注射5-Fu治療后的預后較差。但本研究臨床樣本量較小，且并未對患者行長期隨訪和追蹤，其結論還有待進一步研究。