不同產(chǎn)地白術炮制前后新綠原酸和綠原酸含量變化△

周建新，鄧哲，陳蒙，肖蘇萍，周海燕，杜杰，王繼永

中國中藥有限公司，北京 102600

白術是菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，可用于治療脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等證[1]，主產(chǎn)地有安徽亳州、河北安國、湖北來鳳、重慶秀山、湖南邵陽、四川雅安、四川樂山等[2]。

2020 年國家中醫(yī)藥管理局首次公布古代經(jīng)典名方關鍵信息[3-4]，其中白術處方用藥為生白術。白術中含有揮發(fā)油、內(nèi)酯類、多糖、皂苷、酚酸等多種成分，炮制后，化學成分會有一定的變化。近年來對白術炮制前后的化學成分研究偏重于其所含的多糖和內(nèi)酯類成分。研究發(fā)現(xiàn)，白術經(jīng)炒制后多糖類成分和白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅲ含量均有不同程度的升高，但蒼術酮含量明顯下降[4-5]。現(xiàn)代藥理研究表明，綠原酸類成分具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[6-7]，是白術發(fā)揮藥效的關鍵成分之一，監(jiān)測炮制前后白術中綠原酸類成分含量的變化很有意義。2021年國家藥品監(jiān)督管理局正式發(fā)布了白術配方顆粒質量標準，首次將綠原酸類成分作為其含量測定的指標成分。目前，對炮制前后白術中綠原酸類成分的含量變化相關研究較少，建立的含量測定方法單一[8]。以“白術”“含量研究”為關鍵詞，在中國知網(wǎng)檢索到295篇文獻，其中對白術藥材中的新綠原酸和綠原酸同時測定的文獻僅有1篇，其采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（UPLC-DAD）建立了白術中綠原酸類成分的含量測定方法[9]。但用UPLC建立含量測定方法的成本較高。為全面評價白術藥材及生白術飲片的質量，探索白術炮制前后新綠原酸和綠原酸的含量變化，降低含量測定成本，本研究建立用高效液相色譜法（HPLC）同時測定白術中的新綠原酸和綠原酸含量的方法，研究兩者在炮制過程中的轉移情況，為白術藥材及生白術飲片的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

XM-500UGF型雙頻超聲波清洗儀（小美超聲儀器有限公司）；BX-808 型多功能中藥切片機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試藥

對照品新綠原酸（批號：P30N10L104575，純度：98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；綠原酸（批號：110753-202018，純度：96.1%，中國食品藥品檢定研究院）；水為娃哈哈純凈水；乙腈、磷酸為色譜級。

15 批白術藥材經(jīng)中國中藥有限公司陳彥琳研究員鑒定為菊科植物白術Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，均符合《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定（表1）。

表1 15批白術藥材信息

2 方法與結果

2.1 15批白術藥材炮制

將每批白術藥材揀去雜質及非藥用部位，按大小分檔。凈制后，加水沒過，根據(jù)不同大小，浸泡8～16 h，中間可翻動數(shù)次，至水量降低為加水量的1/2，取出，稍晾至表皮微干，堆潤12 h。使用刨片機中速切制成厚度為2～4 mm 的片，50 ℃鼓風干燥6～8 h，收集裝袋，備用。

2.2 色譜條件

CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～25 min，8%～13%A）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：325 nm；進樣量：10 μL，色譜圖見圖1。

圖1 白術中新綠原酸和綠原酸HPLC圖

2.3 溶液的制備

2.3.1混合對照品溶液的制備 取新綠原酸對照品適量于100 mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容，備用；取綠原酸對照品適量于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后定容，備用；分別吸取新綠原酸和綠原酸對照品溶液1 mL 于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，制得質量濃度分別為9.75、40.44 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備 稱取白術藥材粉末（過三號篩）約1 g置50 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定質量，水浴回流提取60 min，冷卻，用50%甲醇補足質量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1線性關系考察 分別取混合對照品溶液2、4、6、8、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，吸取10 μL 注入高效液相色譜儀。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得新綠原酸標準曲線方程：Y=2 299 295.8X+3 151.80（r=0.999 0），線性范圍為1.950～9.750 μg·mL-1；得綠原酸標準曲線方程：Y=2 548 975.4X+9 504.20（r=0.999 5），線性范圍為8.088～40.440 μg·mL-1。

2.4.2精密度試驗 取樣品（批號：JBZ06）粉末，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示，新綠原酸、綠原酸峰面積RSD 分別為1.18%、0.27%，均低于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗 取樣品（批號：JBZ06）粉末，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件分別在0、4、8、12、24 h 進樣1 次，記錄峰面積。結果顯示，新綠原酸、綠原酸的峰面積RSD 分別為1.74%、0.52%，均低于2%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.4.4重復性試驗 取樣品（批號：JBZ06）粉末，按2.3.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣，記錄峰面積并計算含量。結果顯示，新綠原酸、綠原酸的平均質量分數(shù)分別為0.009%、0.036%，RSD 分別為2.11%、2.24%，表明該測定方法具有良好的重復性。

2.4.5加樣回收率試驗 稱取已知含量的白術藥材，按1∶1 分別加入新綠原酸、綠原酸對照品，平行制備6 份供試品溶液，按2.2項下色譜條件測定，計算回收率及RSD，結果見表2。

表2 白術藥材中新綠原酸和綠原酸加樣回收率考察結果

2.5 不同產(chǎn)地白術藥材和飲片中新綠原酸和綠原酸含量測定結果

取15批不同產(chǎn)地白術樣品，各稱取藥材和飲片粉末（過三號篩）約1 g置50 mL 錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定質量，水浴回流提取60 min，冷卻，用50%甲醇補足質量，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按2.2項下色譜條件進行測定，計算2 個成分的質量分數(shù)（表3）。15 批不同產(chǎn)地白術藥材中綠原酸和新綠原酸含量最高的分別為河北和浙江，其中河北產(chǎn)地白術中的綠原酸平均質量分數(shù)為0.216 3%，浙江產(chǎn)地白術中的新綠原酸平均質量分數(shù)為0.010 8%，結果見圖2～3。通過GraphPad Prism 8軟件對各產(chǎn)地藥材和飲片炮制前后新綠原酸和綠原酸含量進行單因素方差分析（ANOVA），去除轉移率異常情況，結果見圖4。轉移率最高的是浙江產(chǎn)白術，新綠原酸和綠原酸平均轉移率分別為55.68%、55.05%。

表3 15批白術藥材和飲片中新綠原酸和綠原酸質量分數(shù)

圖2 各產(chǎn)地白術藥材中的新綠原酸和綠原酸平均質量分數(shù)（,n=5）

圖3 各產(chǎn)地白術飲片中的新綠原酸和綠原酸平均質量分數(shù)（,n=5）

圖4 各產(chǎn)地白術炮制前后新綠原酸和綠原酸的轉移率（,n=5）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

分別考察了不同梯度、流動相、柱溫、色譜柱對色譜峰分離效果的影響，最終確定色譜條件。

3.1.1起始梯度的選擇 分別考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液（5∶95、8∶92、10∶90），其中起始梯度乙腈-0.1%磷酸水溶液為5∶95 條件下分析時間過長，起始梯度乙腈-0.1%磷酸水溶液為10∶90 條件下，新綠原酸保留時間短，考慮該色譜峰容易與雜質峰重疊未分離，故選擇起始梯度乙腈-0.1%磷酸水溶液（8∶92）。

3.1.2流動相的選擇 分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液條件下各色譜峰均能達到很好分離，但乙腈-0.1%磷酸水溶液條件下色譜峰峰形較好，故選擇其為洗脫流動相。

3.1.3柱溫的選擇 分別考察了柱溫30、35、40 ℃的分離效果，結果表明柱溫對新綠原酸、綠原酸分離無影響，但是隨著柱溫升高，新綠原酸、綠原酸色譜峰保留時間相對提前。結合實際情況，選擇柱溫30 ℃為宜。

3.1.4色譜柱的選擇 分別考察了色譜柱CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、X-Bridge（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hpresil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分離效果，結果顯示色譜柱CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、X-Bridge（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hpresil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）均有較好的分離度，表明不同色譜柱的耐用性均較好。

3.2 提取條件的優(yōu)化

分別考察了不同提取溶劑（甲醇、乙醇、水）、提取溶劑體積分數(shù)（25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇）、提取方式（超聲、回流）、提取時間（30、60、120 min）對白術中新綠原酸和綠原酸提取效果的影響，結果顯示50%甲醇回流提取60 min效果最佳。

3.3 炮制前后新綠原酸和綠原酸含量變化

通過比較不同產(chǎn)地的白術炮制前后新綠原酸和綠原酸的含量，發(fā)現(xiàn)兩者含量均有不同程度的下降趨勢，分別計算浙江和安徽產(chǎn)白術新綠原酸和綠原酸轉移率，結果表明白術在藥材炮制為飲片的過程中成分含量損失50%左右。新綠原酸和綠原酸在植物體內(nèi)分布廣泛，來源于苯丙氨酸代謝途徑，兩者為同分異構體，分子結構均具鄰位酚羥基，易在多酚氧化酶的作用下氧化發(fā)生縮合反應[10]。同時，植物中的苯丙酸類及其衍生物大多具有一定的水溶性[11]，炮制過程中，白術藥材需要浸泡8～16 h，撈出堆潤12 h，此過程會溶出部分新綠原酸和綠原酸，降低兩者在飲片中的含量。另外，烘干溫度也會影響多酚氧化酶的活性，低溫可抑制該酶活性，隨著溫度升高酶活性逐漸增強，達到80 ℃時，酶活性喪失[12]。本研究中，干燥溫度設定為50 ℃，酶活性較強，催化白術中酚酸成分的分解，造成新綠原酸和綠原酸轉移率下降。

此外，還比較了各產(chǎn)地白術中新綠原酸和綠原酸的轉移率，河北產(chǎn)地的白術經(jīng)過炮制后新綠原酸和綠原酸的轉移率顯著低于浙江和安徽產(chǎn)白術。本研究中，河北產(chǎn)白術大小明顯小于浙江和安徽，推測可能是浸泡和堆潤的時間過長導致，后續(xù)炮制工藝改進需要調(diào)整浸泡和堆潤時間。

4 結語

本研究以白術中的新綠原酸和綠原酸作為指標成分建立的含量測定方法可為白術及其炮制品的質量評價提供參考，初步揭示了白術炮制前后新綠原酸和綠原酸含量的變化情況，可為進一步優(yōu)化白術炮制工藝提供參考。