不同生長年限云南重樓藥材質量比較研究△

王璇，賈天穎，珍桑拉姆，徐文娟，李春帥，楊琳琳，張姝妍，文佳，程水清，王旭星，徐新房，李向日*

1.北京中醫藥大學 中藥學院/北京市中藥品質評價重點實驗室，北京 102488；

2.北京市同仁堂股份有限公司 同仁堂制藥廠，北京 102629

百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.為《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版規定的中藥重樓基原之一[1]，以根莖入藥，味苦，性微寒，有小毒，歸肝經，具有清熱解毒、消腫止痛、止血等作用，能夠治療蛇蟲咬傷、跌打損傷、驚風抽搐等[2]。其含有甾體皂苷、黃酮、植物甾醇及植物蛻皮激素等多種化學成分[3]，其中甾體皂苷類為主要活性成分[4]，以薯蕷皂苷類、偏諾皂苷類和原型皂苷類為主，約占化合物總質量分數的80%[5]。現代研究表明，薯蕷皂苷在抗腫瘤、抗感染、調血脂、降血糖等方面有良好的藥理活性[6]；偏諾皂苷則在鎮痛、抗炎等方面療效突出[7]。在《中國藥典》2020 年版中將薯蕷皂苷類的重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ及偏諾皂苷類的重樓皂苷Ⅶ作為重樓質量控制的指標成分，規定其總量不得少于0.60%[8]。

近年來，隨著市場對重樓藥材需求量的增加，其價格突飛猛漲，刺激了藥農采挖的積極性，野生重樓資源已呈瀕臨滅絕之勢[9]。為緩解重樓資源緊張問題，云南重樓的人工栽培規模不斷擴大[10]。然而，因其為多年生草本植物，種子休眠期長，生長周期緩慢，種植者為保證藥材質量，往往需要栽培數年。為保證重樓藥材質量和種植者利益，科學選擇種植年限尤為重要。本研究依據課題組前期建立方法[11]，對不同生長年限云南重樓的外觀性狀、浸出物及9 種重樓皂苷的含量進行比較，旨在為云南重樓種植年限選擇和質量控制提供參考。

1 材料

1.1 樣品

于2017 年在云南省會澤縣駕車鄉采集4 年生、5 年生、6 年生、7 年生、8 年生云南重樓各3 批，樣品信息見表1，經中國科學院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.的干燥根莖，標本藏于云南省藥物研究所。

表1 云南重樓藥材樣品信息

1.2 儀器

2695 型高效液相色譜儀（包括2489 型紫外檢測器，美國Waters 公司）；KQ-500DE 型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA-1004 型電子分析天平（上海天平儀器廠）；PL2002 型電子天平（梅特勒-托科多儀器有限公司）。

1.3 試藥

對照品重樓皂苷Ⅰ（批號：111590-201604，純度：93.6%）、重樓皂苷Ⅱ（批號：111591-201604，純度：91.4%）、重樓皂苷Ⅵ（批號：111592-201604，純度：97.0%）、重樓皂苷Ⅶ（批號：111593-201604，純度：94.0%）、薯蕷皂苷（即重樓皂苷Ⅳ，批號：111707-201703，純度：96.1%）均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品纖細薯蕷皂苷（即重樓皂苷Ⅲ，批號：CF0227QC14，純度：98%）、重樓皂苷Ⅴ（批號：Y19F7H9835，純度：98%）、重樓皂苷H（批號：C12A8G33615，純度：98%）均購于上海源葉生物科技有限公司；對照品重樓皂苷D（批號：16063003，純度：97%，成都普菲德生物科技有限公司）；乙腈（色譜級，美國Fisher 公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 性狀鑒別

按《中國藥典》2020 年版（一部）“重樓”項下方法[1]對云南重樓藥材的表皮顏色、斷面顏色、質地進行鑒別，同時測定藥材的單個質量。

2.2 浸出物測定

按參考文獻[11]方法測定藥材浸出物質量分數。

2.3 含量測定

按參考文獻[12]方法測定云南重樓樣品中重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D和重樓皂苷H的含量。

2.4 統計分析

采用SPSS 25軟件對云南重樓生長年限與薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷含量進行相關性分析；組間比較采用單因素方差分析，運用GraphPad Prism 5軟件對藥材的薯蕷皂苷（重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅳ、重樓皂苷Ⅴ）、偏諾皂苷（重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷D、重樓皂苷H）及總皂苷含量進行分析；采用SⅠMCA 13軟件進行主成分分析（PCA），考察不同年限云南重樓與不同種類皂苷含量間的關系。

3 結果

3.1 性狀鑒別

3.1.1外觀性狀 4 年生云南重樓樣品過小，長度不符合《中國藥典》2020 年版標準，5 年及以上云南重樓樣品性狀基本符合《中國藥典》2020 年版要求。5 年及以上云南重樓樣品藥材表面特征較為明顯，可見層狀突起的粗環紋，一面結節明顯，結節上可見橢圓形凹陷莖痕，另一面有疏生的須根或疣狀須根痕，頂端具鱗葉和莖的殘基；云南重樓表皮多為黃棕色，斷面多為白色至乳黃色，均呈粉質。不同生長年限云南重樓藥材外觀性狀明顯，差異多體現在長度和直徑，隨著生長年限的增長，云南重樓的長度、直徑均明顯增長。同時，隨著生長年限的增加，藥材性狀差異逐漸變大，7 年生、8 年生云南重樓性狀更接近拳狀。不同生長年限云南重樓藥材外觀性狀見圖1。

圖1 不同生長年限云南重樓藥材外觀性狀

3.1.2單個質量 云南重樓單個質量一定程度上可以反映藥材的質量，如表2 所示，云南重樓藥材質量隨生長年限的增長而增加，8 年生云南重樓藥材質量最大。

3.2 浸出物

不同生長年限云南重樓藥材浸出物質量分數見表2。其中，8 年生樣品的醇溶性浸出物質量分數最高。

表2 不同生長年限云南重樓藥材單個質量、浸出物測定結果

3.3 含量測定

對9 種重樓皂苷類成分含量進行測定，結果見表3。由測定結果可知，隨著生長年限增加，云南重樓藥材9 種重樓皂苷的含量發生不同程度的變化。其中，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ的含量隨生長年限增長而增加的趨勢較明顯，且在7年生藥材中含量最高。藥材中9種重樓皂苷含量個體差異較明顯，所含皂苷以薯蕷皂苷為主。薯蕷皂苷類含量（如重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ）隨生長年限增長而增加，而偏諾皂苷含量隨年限增長未發現明顯變化規律。從9 種重樓皂苷含量來看，云南重樓的薯蕷皂苷及總皂苷含量以7 年生含量為最高。根據薯蕷皂苷、偏諾皂苷及總皂苷的含量測定結果進行PCA，結果見圖2。數據顯示，可將不同年限藥材分為2 類，其中7 年生、8年生為一類，4年生、5年生、6年生為一類，提示7 年生、8 年生藥材較其他生長年限藥材在有效成分含量上存在較大差異。《中國藥典》2020 年版“重樓”項下規定，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ和重樓皂苷Ⅶ的總量不得少于0.60%[1]，而本研究結果顯示，7 年生、8 年生樣品均達到規定，6 年生樣品1 批未達標準，而4年生、5年生樣品均不合格。

圖2 不同生長年限云南重樓PCA圖

表3 云南重樓樣品中重樓皂苷質量分數（n=4）

3.4 統計分析

3.4.1相關性分析 采用SPSS 25軟件對生長年限與薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷含量間進行相關性分析，結果見表4。雙變量Pearson檢驗結果顯示，生長年限與薯蕷皂苷、總皂苷含量均呈正相關（r1=0.645，P=0.009＜0.01；r2=0.668，P=0.007＜0.01），適宜采用多元統計分析方法進行進一步分析。

表4 云南重樓生長年限與3類皂苷含量的相關性分析

3.4.2PCA 采用SⅠMCA 13 統計軟件，基于薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷的含量測定結果對不同年限的云南重樓藥材進行PCA，結果見圖2。正交偏最小二乘-判別分析法（OPLS-DA）分析結果顯示，不同年限的云南重樓藥材可明顯分為2類，其中7年生、8 年生為一類，4年、5年、6年生為一類，說明根據薯蕷皂苷、偏諾皂苷、總皂苷含量可以很好地區分不同生長年限的云南重樓藥材，且7年生、8年生藥材的質量較好。

綜上可知，從外觀性狀、浸出物、有效成分含量來看，生長年限對云南重樓的質量有較大影響，隨著生長年限的增加，云南重樓藥材外觀性狀發生明顯變化，單個質量、浸出物均明顯增長，各種有效成分含量也發生一定程度的規律性變化。其中，7 年生、8年生藥材有效成分含量差異較小，考慮到種植者的收益，經各項指標綜合評價得出結論，建議云南重樓藥材的栽培年限為7年。

4 討論

生長年限是影響云南重樓藥材質量的關鍵因素，種植年限不同往往會直接導致藥材外觀性狀、浸出物及有效成分含量存在較大差異。本研究發現，于外觀性狀而言，4 年生藥材長度過小，5 年生及以上藥材才能達到《中國藥典》2020年版規定；8 年生藥材浸出物含量高于其余生長年限，提示生長年限的增加有助于有效成分的積累，使浸出物含量增加。值得一提的是，本研究所收集的云南重樓即使是相同生長年限，其浸出物含量仍存在較大差異，所得數據暫未發現統計學差異，這可能是由于樣品產地不同，個體差異較大所致，其具體原因值得課題組后續深入研究。與此同時，隨著生長年限的增加，9 種重樓皂苷含量也會發生較大變化，7年生、8 年生藥材較其他年生藥材存在明顯差異。以上結果均說明，種植年限是藥材質量的重要影響因素，科學合理選擇種植年限是保證云南重樓藥材質量的關鍵。

隨著臨床需求不斷增大和藥農長期掠奪式采挖，目前很多中藥面臨野生資源匱乏不能滿足藥用的問題，尤其是以多年生藥用植物的根及根莖部位入藥的藥材，如防風、三七、白芍等[13]，故多地進行了各類藥材的人工栽培研究。雖然人工栽培是緩解野生資源壓力的有效途徑[14]，但在栽培過程中遵從科學的種植方法、保證藥材質量尤為重要。本研究采用傳統經驗鑒別結合9 種重樓皂苷含量測定的方法對不同生長年限云南重樓藥材質量進行評價，提出藥材種植年限的合理建議，從而在提高云南重樓藥材產量的同時保證藥材質量，為中醫臨床安全有效用藥提供保障。