海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多態性與糖尿病視網膜病變關系

吳清靜 ，吳佩佩，魯 曉，彭 立,2 ，邢 球， 謝 青

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是一種常見的致盲眼病，是最嚴重和最常見的糖尿病微血管并發癥之一，已在中老年人群中成為最常見的導致視力損害和不可逆性失明的原因之一[1-2]，DR在糖尿病人群中的患病率大約為三分之一，其中十分之一的人有視力下降，如糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)或增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy, PDR)。DR發病機制復雜，目前尚無明確一致的發病機制可以解釋該疾病的發生發展。DR 的發生發展與糖尿病本身以及患者的血糖控制情況密切相關，此外DR的發生亦具有顯著的個體差異和家庭聚集性。有文獻報道DR的發生有27%的遺傳可能性，PDR患者的遺傳性更高，可達52%[3]，DR的發生、發展與遺傳因素有著密切的關系。

DR患者的視功能和生存質量隨著DR的發展受到嚴重的影響[4-5]，早期發現高風險的DR患者，早期提供最佳的預防和治療措施，將極大地改善DR患者的視功能預后與生活質量。臨床上DR損害患者視功能的主要原因為視網膜新生血管的生成和黃斑水腫的發生，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在DR新生血管的生成中扮演者重要角色，有著密切的關系[6]。

近幾年分子生物學研究得到快速發展，識別早期診斷的生物標志物、預后預測和DR的靶向治療是非常重要的[7]，關于DR在基因層面的科學研究逐漸增多，不斷引起學者的重視，生長因子基因多態性與DR 發生發展的關系研究是當前國內外研究熱點，對評價DR的嚴重程度以及探索新療法的研究中起著重要的作用，為研究DR新的治療靶點提供重要的依據和支持。黎族屬于少數民族，中國有125萬黎族人口，其中111萬來自海南[8]，而海南作為中國唯一的熱帶地區，本地區的人群的基因多態性與DR 相關性的研究鮮有報道，我們旨在探索海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多態性與DR的關系，為早期糖尿病患者的預防、診斷提供有力的依據。

1對象和方法

1.1對象前瞻性研究。隨機收集2016-09/2019-10海口市人民醫院眼科和內分泌科住院的海南黎族2型糖尿病患者89例，其中男49例，女40例。依據世界衛生組織(WHO)推薦的糖尿病診斷和糖代謝狀態分類標準實施。納入標準：同時滿足以下要求：(1)2型糖尿病；(2)祖籍為海南黎族，3代以上父母雙方均為海南黎族人；(3)糖尿病病程≥8a；(4)所有患者均接受眼科檢查(最佳矯正視力、裂隙燈顯微鏡+90D非接觸鏡、眼底照相、OCT、FFA)。排除標準：(1)患有酮癥酸中毒、心力衰竭、高血糖高滲性昏迷、腦梗塞急性期、尿毒癥(肌酐≥707μmol/L)、妊娠期糖尿病、1型糖尿病者；(2)既往有高血壓性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、眼底血管樣條紋、中心性漿液性視網膜病變、中心性滲出性脈絡膜視網膜病變、息肉狀脈絡膜血管病變、年齡相關性黃斑變性、視網膜靜脈周圍炎、脈絡膜新生血管病史者。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，通過海口市人民醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1一般資料收集通過問卷咨詢調查、查閱相關病例、進行相關體格檢查和實驗室檢查進行臨床各項指標的收集。所有患者禁食12～14h，晨起空腹抽取肘靜脈血，應用全自動生化儀測肌酐、尿素、總膽固醇、甘油三酯；低壓液相層析柱法(EDTA抗凝全血，EDTA:血量=1.5mg/mL)測糖化血紅蛋白(HbA1c)。

1.2.2提取基因組DNA 采集納入研究對象的EDTA抗凝血3mL，按照實驗步驟提取研究對象的基因組DNA。

1.2.3檢測基因多態性應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性檢測分析法對研究對象提取的樣本進行基因多態性檢測。引物的設計根據基因序列和相關文獻。VEGF基因rs2010963位點PCR擴增全長度為224bp，上游引物為5’-GGATTTTGGAAACCAGCAGA-3’，下游引物為5’-CTGTCTGTCTGTCCGTCAGC-3’。VEGF基因rs3025039位點PCR擴增全長度為317bp，上游引物為5’-GGGAACCAGATCTCTCACCA-3’，下游引物為5’-TGTATGTGGGTGGGTGTGTC-3’。PCR反應體系中含2X Goldstar Buffer Mix 10μL，H2O 6μL，DNA 100ng(≈1μL)，Primer Mix 3μL。將配置好的PCR反應體系液置入PCR檢測儀里，按照實驗步驟進行下一步的PCR檢測。按照實驗步驟進行樣品的基因測序，隨后進行上機電泳，應用ABI 3130/ABI 3130XL測序儀實施樣品的測序，對樣品的rs2010963、rs3025039位點進行相關檢測。

2結果

2.1三組患者臨床資料比較參照中華醫學會眼底病學組的標準對DR進行分組：非增殖期DR(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)患者30例和增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者33例。將2型糖尿病無視網膜病變(diabetic without retinopathy,DWR)患者26例作為對照。三組患者平均年齡、糖尿病病程、收縮壓、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、糖化血紅蛋白比較差異均無統計學意義(P>0.05)；PDR患者尿素、肌酐水平較DWR和NPDR組顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.016667)，見表1。

表1 三組患者臨床資料比較

2.2三組患者VEGF基因rs2010963檢測結果三組患者均存在CC、CG及GG三種基因型和C、G兩種等位基因，見圖1。該位點的基因型分布頻率與Hardy-Weinberg平衡定律一致。三組患者各基因分布情況見表2。Fisher精確檢驗結果顯示三組患者CC基因型比較差異有統計學意義(P=0.003)，進一步兩兩比較顯示：DWR和NPDR組差異有統計學意義(P=0.014)，NPDR組和PDR組差異無統計學意義(P=0.435)，DWR和PDR組差異有統計學意義(P=0.002)。三組患者CG基因型比較差異有統計學意(χ2=10.046，P=0.006)，進一步兩兩比較顯示：DWR和NPDR組差異無統計學意義(P=0.067)，NPDR組和PDR組差異無統計學意義(P=0.168)，DWR和PDR組差異有統計學意義(P=0.002)。三組患者GG基因型比較差異無統計學意義(χ2=0.230，P=0.893)。三組患者C和G等位基因分布比較差異均無統計學意義(χ2=3.384，P=0.184;χ2=3.384，P=0.184)，見表2。結果提示CC基因型增加PDR的易感性。

圖1 海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963位點各基因型測序圖 A：CC基因型；B：CG基因型；C:GG基因型。

表2 三組患者VEGF基因rs2010963基因型及等位基因分布比較n(%)

2.3三組患者VEGF基因rs3025039位點檢測結果三組患者均存在C、T兩種等位基因和CC、CT兩種基因型，NPDR和PDR組還存在TT基因型，見圖2。三組患者VEGF基因rs3025039基因型及等位基因分布比較見表3。

圖2 海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs3025039位點各基因型測序圖 A：CC基因型；B：CT基因型；C:TT基因型。

表3 三組患者VEGF基因rs3025039基因型及等位基因分布比較n(%)

Fisher精確檢驗結果顯示，三組患者CC、CT、TT基因型比較差異均無統計學意義(P=0.835、0.950、0.773)。三組患者C和T等位基因分布比較差異均無統計學意義(χ2=1.028，P=0.598；χ2=1.028，P=0.598)。

2.4三組患者不同基因型與PDR發生率的比較與基因型為TT的研究對象相比，等位基因C攜帶者患PDR的危險性較高[82%(54/66)vs6%(2/33)]。

3討論

本研究采用PCR結合DNA測序法方法首次對中國海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963和rs3025039的單核苷酸多態性進行研究。以上兩個單核苷酸位點在VEGF的轉錄及翻譯過程中起著不容忽視的重要作用，但因種族、地區及生活方式的不同，它們與DR的相關性存在較大差異。海南島地理位置特殊，有獨特的海洋氣候，黎族是海南的土著居民，歷代多居住于山地及丘陵地帶，缺乏與外界交流，再加上相對封閉保守的婚戀原則，與外族人通婚較少，導致黎族基因具有其保守性和獨特性，目前鮮有黎族人群的相關報道。單核苷酸多態性的研究較多[9]，是人類最常見的遺傳變異形式，估計占人類遺傳變異的90%以上，是當基因組序列中的單個核苷酸發生改變時所發生的DNA序列變異，在多種人類疾病的發生發展中起著重要作用[10]。VEGF是一種有效的血管生成和血管通透性因子，其多態性與DR的發生發展相關[11]。

Watson等[12]對英國健康人群進行研究發現VEGF基因單核苷酸多態性與VEGF蛋白表達有關，其中rs2010963位點攜帶G等位基因可使VEGF基因轉錄增強，從而使VEGF蛋白濃度增加。且攜帶GG基因型的個體血漿VEGF含量最高，CG基因型次之，CC基因型的含量最低。rs2010963中的CC基因與VEGFA分泌減少有關[13]。我們的研究結果顯示，DWR組、NPDR組與PDR組中均存在CC、CG及GG三種基因型和C、G兩種等位基因。三組中CC基因型分布頻率分別約為4%、30%和39%，CG基因型頻率分別為58%、33%、和18%，GG基因型分布頻率依次是38%、37%和42%。與DWR相比，PDR組CC基因型頻率顯著增高，CG基因型明顯降低，NPDR組CG基因型略降低。在海南黎族2型糖尿病患者中，rs2010963位點的CC基因型增加PDR的易感性。我國學者Yuan等[10]對河北石家莊地區的漢族2型糖尿病患者進行基因位點研究發現NPDR組、PDR組與無DR組在rs2010963位點的基因型和等位基因分布頻率上無顯著差異。文獻報道對中國臺灣地區糖尿病患者進行基因檢測發現攜帶CC或CG基因型的患者的DR患病率明顯高于攜帶GG基因型患者，且C等位基因患者中VEGF的表達水平增高[14]。伊朗學者Fegghi等[15]研究發現在rs2010963位點GG基因型是PDR患者的獨立危險因素，攜帶GG基因型患PDR的概率為攜帶CC基因型的1.87倍。韓國的一項研究顯示，韓國2型糖尿病人群中PDR、NPDR、DWR在rs2010963位點上各基因型及等位基因上無明顯差異[16]。文獻報道CC基因型在DWR組中比例最高，而GG基因型則在PDR組中比例最高，差異具有統計學意義[17]。rs2010963在其他疾病中也被報道過，如冠狀動脈疾病發生風險相關[18]，與先兆子癇發生風險有顯著的相關性[19]。rs2010963位點與VEGF基因的激活蛋白-1緊密連接，參與VEGF蛋白產物的表達[20]，且還有研究發現它可以改變VEGF基因啟動子的反應活性[21-22]。不同地區的人群，不同的民族群體間在rs2010963存在多態性。VEGF的增加導致PDR的發生，視網膜缺血是VEGF分泌的主要刺激因子，導致PDR[23]。

rs3025039位點可通過激活蛋白-4發揮作用，調節血漿VEGF水平[24-25]。這些位點的多態性都可能影響VEGF的轉錄水平或表達水平，與DR的發生、發展密切相關。一項Meta分析顯示在等位基因模型中發現rs3025039(C>T)多態性與DR風險增加顯著相關[26]。我們的研究顯示三組之間rs3025039在等位基因分布方面差異無統計學意義，但是NPDR和PDR組還存在TT基因型，黎族2型糖尿病患者患者在rs3025039位點單核苷酸多態性與DR的發生相關性不顯著，可能與我們的人群特性有關。此外，不同的DME患者個體對抗VEGF治療的反應并不相同，DME抗VEGF治療反應的個體間差異可能部分是由于VEGF基因的多態性和/或VEGF基因表達的差異所致[27]。因此，VEGF的單核苷酸多態性可能在DR的發生與發展中起著重要作用，VEGF基因的多態性可能在抗VEGF的治療反應中起到決定性作用。

在國內海南黎族的人群中，rs2010963和rs3025039尚未被報道過。本研究也存在局限性，首先我們的研究樣本量有限，可能不能完全評估基因的多態性情況，其次雖然我們首次對海南黎族人群進行了研究，但是缺少大樣本的和漢族人群的對比研究。

綜上所述，海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因rs2010963位點的CC基因型較CG基因型增加糖尿病患者DR的易感性，海南黎族DR患者主要為CC基因型。而在rs3025039位點上，黎族NPDR和PDR組還存在TT基因型，在rs3025039位點單核苷酸多態性與DR的發展相關不顯著。本研究運用PCR-RFLP技術測定VEGF基因型，探索海南黎族2型糖尿病患者VEGF基因多態性與DR的相關性，探尋DR發生的遺傳學證據，為早期預防、診斷提供有力的依據，期望能為DR提供更有效的治療手段。