血清TIPE2 在慢性腎小球腎炎中的表達和意義

齊建軍，楊麥青，張 林，汪 釗，王艷峰

（1.昌邑市人民醫院腎內科，山東 昌邑 261300；2.昌邑市人民醫院病理科，山東 昌邑 261300；3.北大荒集團總醫院病理科，黑龍江 哈爾濱 150088）

慢性腎小球腎炎（chronic glomerulonephritis，CGN）是一類自身免疫性疾病，是以慢性蛋白尿、血尿、高血壓等為主要臨床癥狀的慢性腎炎，其發病機制復雜，病情緩慢且容易反復，且患者的生存質量一般[1]。腎組織炎癥反應的嚴重程度取決于局部促炎因子和保護機制的平衡，早期診斷可以及早干預腎組織的繼續損傷，提高患者的生存質量。腎組織穿刺病理診斷是慢性腎小球腎炎的金標準，可以明確腎臟損傷的程度及具體分型，同時可以指導治療、評估預后[2]，但活檢穿刺術的風險較大。尋找能用于CGN早期診斷的臨床指標是科研人員研究的熱點。腎炎的發病機制復雜，通過腎臟病理改變發現，腎纖維化進展包括腎小管的損傷、間質纖維化和炎細胞浸潤在腎炎的發生發展中是一個持續發展的病理過程，包括免疫調控失衡和致纖維化發展的致病因子的作用。腫瘤壞死因子-α 誘導蛋白-8 樣分子-2（tumor necrosis factor-α induced protein 8 like 2，TIPE2）是一種免疫負調控分子，也是體內維持免疫動態平衡的必須蛋白之一，可以負性調節免疫反應應答、控制炎癥反應[3]。近幾年研究顯示[4]，文獻報道在哮喘、類風濕、惡性腫瘤[5-8]多種疾病中存在TIPE2 表達水平的改變。血清轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）家族成員是多能細胞因子，參與細胞分化、器官發育、創傷愈合和免疫調節等多種細胞過程。TGF-β1在炎癥、組織修復和胚胎發育過程中起重要作用，但也能促成一些自身免疫性疾病的發生發展[9-11]。本研究通過檢測患者外周血單個核細胞TIPE2 的表達水平和血TGF-β1的表達水平，并結合分析與常見的一般臨床特征和臨床病理參數及與TGF-β1之間的關系，探討TIPE2 在CGN 發生發展中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年10 月-2021 年6 月昌邑市人民醫院腎內科住院的初次診治的CGN 患者45例設為CGN 組，同期健康體檢者20 例當作對照組。納入標準：①年齡≥18 歲；②CGN 組患者經活檢病理診斷確診為原發性腎小球腎炎除外繼發性腎小球腎炎及遺傳性腎小球腎炎。排除標準：①其他自身免疫性疾病累及腎臟損害；②合并感染；③合并嚴重心腦血管疾病；④既往腎臟手術史；⑤合并惡性腫瘤；⑥哺乳期女性和孕婦。兩組研究對象年齡、性別、體質指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1，研究可比。本研究經過昌邑市人民醫院醫學倫理委員會審查通過，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。根據慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）疾病分期進一步將CGN 患者分為CKD1-2 期26 例，CKD3-5 期19 例，P＞0.05，見表1）。

表1 兩組一般資料比較（，n）

表1 兩組一般資料比較（，n）

1.2 方法

1.2.1 標本留取 采集所有納入實驗的患者清晨空腹靜脈血3 ml，室溫下自然凝固，將血樣本轉移到離心管內，離心取上清液，備用。

1.2.2 血液生化指標 由醫院檢驗科貝克曼庫爾特AU5800 全自動生化分析儀檢測其中腎功能指標血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

1.2.3 血清學TIPE2、TGF-β1的表達水平檢測 抽取受試者空腹血，將1 ml 抗凝血與等量的生理鹽水充分混勻，在離心管內加入0.5 ml 淋巴細胞分離液進行分離，離心后管內分為3 層，在中上層交界處的白色云霧層，即單個核細胞層，單個核細胞中TIPE2水平的測定采用實時定量-聚合酶鏈式反應。提取RNA，然后進行RNA 逆轉錄和PCR 擴增。使用定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測基因的表達，以β-actin為參照基因。PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。所需試劑盒購買自TaKaRa 公司，嚴格按照說明書進行操作。結果采用2-△CT 法分析。血清TGF-β1采用雙抗體夾心ABC-ELISA 法，ELISA 試劑盒購買自R&D 公司，嚴格按照說明書進行操作，使用美國全自動酶聯檢測儀測定吸光度，根據標準曲線及標準公式計算受試樣本的濃度（pg/ml）。

1.2.4 腎臟病理 所有病例組均在B 超引導下腎穿刺活檢，所有活檢組織進行HE、PAS、PASM 等常規染色。對腎間質損傷程度進行半定量評分，評分標準參考Katafuchi 評分，腎間質損傷：腎小管萎縮、炎細胞浸潤、小管萎縮評分為0～9 分[12]。≤3 分判讀為輕度腎間質損傷（24 例），＞3 分判讀為中重度腎間質損傷（21例）。CGN 組45 例經腎臟穿刺病理活檢，結果分別為系膜增生性腎小球腎炎（16 例）、膜性腎病（7 例）、系膜毛細血管性腎小球腎炎（9 例）和局灶性腎小球硬化（13 例）4 種病理類型，符合CGN 診斷標準。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料使用（n）表示，比較采用χ2檢驗、秩和檢驗，并采用Pearson 相關性分析，ROC 曲線分析TIPE2對于CGN 的診斷敏感性，P＜0.05 表示差異有統計學意義，P＜0.01 表示統計學意義顯著。

2 結果

2.1 兩組血尿素氮、肌酐、TIPE2、TGF-β1的表達水平比較 CGN 組TIPE2 mRNA 相對表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；CGN 組血清尿素氮、肌酐、TGF-β1的表達水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 兩組血清尿素氮、肌酐、TIPE2、TGF-β1 表達水平比較（）

表2 兩組血清尿素氮、肌酐、TIPE2、TGF-β1 表達水平比較（）

圖1 兩組TIPE2 相對表達量比較

2.2 TIPE2 與CGN 患者臨床因素分析

2.2.1 TIPE2 與CGN 患者臨床因素的關系 對CGN患者根據血清TIPE2 mRNA 相對表達量分為TIPE2低表達組（≤1.5）14 例和TIPE2 高表達組（＞1.5）31 例,分析TIPE2 與患者年齡、性別、體質指數、血清尿素氮、肌酐、TGF-β1、CKD 分期的關系，結果顯示，血清TIPE2 mRNA 相對表達量的高低與患者的年齡、性別、BMI 無關（P＞0.05）；與血清尿素氮、肌酐、TGF-β1的表達水平及CKD 分期有關（P＜0.05），見表3。

表3 TIPE2 與CGN 患者臨床因素的關系（，n）

表3 TIPE2 與CGN 患者臨床因素的關系（，n）

2.2.2 TIPE2 與實驗室檢查項目的相關性分析Pearson相關性分析TIPE2的表達與Scr、BUN、TGF-β1的相關性的結果顯示，TIPE2 的表達與Scr（r=0.300，P=0.022）、BUN（r=0.262，P=0.041）、TGF-β1（r=0.443，P=0.001）的表達分別呈正相關。

2.3 血清TIPE2 表達水平與腎臟病理因素分析 血清TIPE2 mRNA 相對表達量與腎臟間質損傷程度有關（P＜0.05）；而經病理診斷分型中系膜增生性腎小球腎炎、膜性腎病、系膜毛細血管性腎小球腎炎和局灶性腎小球硬化4 種病理類型分組之間TIPE2的表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 TIPE2 表達與腎臟病理因素分析（n）

2.4 TIPE2 的ROC 曲線 以血清TIPE2 水平判斷CGN，繪制ROC 曲線結果顯示，TIPE2 的AUC 為0.739（P＜0.01），見圖2。

圖2 血清TIPE2 水平的ROC 曲線

3 討論

CGN 的發病機制非常復雜，對于CGN 的病因學和預防治療仍沒有確切的結果。但自身免疫系統的紊亂在CGN 的發生發展中是關鍵環節之一。雖然近幾年CGN 的治療有了很大的發展，但CGN 病情的反復性仍然是治療的難點，在疾病的早期階段，腎功能損傷較輕，早期發現和早期診斷對于CGN 至關重要，迫切需要尋找CGN 發生發展中可用于早期診斷的新的標記物。

腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導蛋白8（TNFAIP8/TIPE）家族，包括TNFAIP8（TIPE）、TNFAIP8樣蛋白1（TNFAIP8L1/TIPE1）、TNFAIP8 樣蛋白2（TNFAIP8L2/TIPE2）和TNFAIP8樣蛋白3（TNFAIP8L3/TIPE3），在調節炎癥反應、免疫穩態和癌癥發展中起著重要作用[13]。TIPE2 是該家族的成員之一。近幾年研究表明，TIPE2 是炎癥反應和免疫穩態的重要調節因子，參與免疫調節。國內外研究報道TIPE2 在類風濕、慢性肝炎、哮喘等多種疾病中出現異常表達[3，4，14]。文獻報道TIPE2 在移植排斥反應中有重要的免疫調節作用，顯著減少免疫排斥反應，可作為監測慢性腎移植排斥反應的生物標志物[15，16]。在對腫瘤的研究中，發現在肝細胞肝癌、胃癌、乳腺癌中TIPE2 表達降低[5，7，8]，而在肺癌、腎癌、非霍奇金淋巴瘤中表達增高[6，17，18]，提示TIPE2 在人類不同疾病中的作用不同，可能在某種疾病的某個階段所起的作用不同，也可能跟實驗涉及的樣本數有關，其具體機制未完全了解。

本研究發現TIPE2 在CGN 患者外周血單個核細胞中的表達高于正常對照組，ROC 曲線結果顯示，TIPE2 的AUC 為0.739（P＜0.01），表明TIPE2 可以用于診斷CGN。并且TIPE2 的表達與血清尿素氮、肌酐的表達水平呈正相關，TIPE2 與腎間質損害的程度有關，說明TIPE2 在一定程度上參與了腎炎的發生發展，TIPE2 可以用于評估腎間質的損傷程度，但TIPE2 在腎炎發生發展的作用機制復雜。

但TIPE2 在CGN 中的研究相關報道甚少，在本研究通過對CGN 病理活檢的研究發現，TIPE2 與腎臟間質損傷程度有關，而CGN 病情的發展伴隨著腎間質炎細胞浸潤和腎間質纖維化的發展。腎纖維化是一個動態的病理生理過程，包括腎小管細胞損傷/凋亡、炎癥細胞浸潤、間質成纖維細胞活化和過量的細胞外基質合成/沉積，導致腎功能受損，最終導致慢性和終末期疾病。TGF-β 通過上調基質蛋白合成、抑制基質降解和改變細胞間相互作用在腎組織纖維化中發揮重要作用[19]；其中TGF-β1具有多種生物學活性，被認為是組織纖維化的關鍵介質，TGFβ1可以參與CGN 的發展，并能反映CGN 的活動性，TGF-β1是腎纖維化的主要驅動因素[20]。本研究結果顯示，CGN 患者血清中TGF-β1表達較正常人顯著增高，其在腎組織內的過度表達，可產生明顯的致纖維化作用，加重腎間質的纖維化發展，且TIPE2 的表達與TGF-β1呈正相關性，說明TIPE2 在CGN 的發生發展中與TGF-β1的作用有一定關聯。

綜上所述，TIPE2 在CGN 中的發生發展與TGF-β 通路的作用有一定關聯。CGN 患者血清TIPE2、TGF-β1的水平明顯增高，TIPE2 與TGF-β1的表達水平呈正相關，血清TIPE2 用于診斷CGN 的敏感性較高。