莪術醇對肝細胞癌miR-629、miR-24、miR-130a、miR-17 的影響

黎桂玉，林基勇

（1.廣西中醫藥大學基礎醫學院，廣西 南寧 530200；2.深圳市中醫院感染性疾病科，廣東 深圳 518000）

肝癌（liver cancer）是世界上第六大常見癌癥，也是癌癥死亡的常見原因之一[1]，其死亡率在所有癌癥中的排名近年有上升趨勢，2018-2020 年，從第四位躍居第三位[1，2]。肝癌是一種高發病率惡性腫瘤，在2020 年全球癌癥發病率統計結果中，肝癌占據全世界癌癥發病總數的4.7%[1]。就發病率來言，我國屬肝癌大國，據世界衛生組織2020 年最新數據顯示，全球肝癌發病人數的一半以上出現在中國，其年齡標準化發病率為18.2/105，在全球排名第八，而因肝癌死亡的人數每年達38.3 萬人左右，這使我國的肝癌死亡率占全世界一半以上。總之，全球尤其是我國的肝癌疾病負擔重，嚴重威脅公眾健康。據2019 年全國腫瘤登記資料記錄，廣西是肝癌的高發區[3，4]。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌的主要類型，占病例總數的75%～85%[1]。肝細胞癌的主要危險因素是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）或丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染、黃曲霉毒素污染的食物、大量飲酒、超重、2 型糖尿病和吸煙等。在中國，肝細胞癌的發生發展的關鍵因素是HBV[5]。雖然通過提高衛生標準、篩查血液用品和注射疫苗，HBV 的感染率得到控制，但HBV 的感染率仍然較高。其進一步加重肝細胞癌的疾病負擔，給肝細胞癌的治療增加了難度。肝細胞癌的防治研究是當前學術界的熱點和難點，雖然進展顯赫，但用于治療的有效、無副作用藥物仍然十分稀缺。因此，迫切需要探索治療肝癌的替代方法。廣西道地藥材莪術，在廣西境內分布廣泛，資源豐富，為廣西盛產藥材[6-9]。越來越多的研究顯示，莪術的有效成分莪術醇有明顯的抗腫瘤、抑制肝癌、保肝抗炎的作用[10-13]。小分子核糖核酸（microRNAs，miRNAs）在肝癌中異常表達，調節肝癌發生及發展[14-17]。有研究顯示，莪術醇能抑制促癌基因miR-21 的表達從而發揮抗肝癌作用[18-21]；莪術醇可通過調控microRNAs 的表達呈現抑制肝癌的作用[22，23]。miR-629、miR-24、miR-130a 和miR-17 在肝癌發生及進展中發揮重要作用。研究顯示，miR-629、miR-24 在肝細胞癌中表達明顯升高[24]，miR-130a[25]和miR-17-3P 在肝細胞癌中表達下降。但莪術醇對肝癌miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P 和miR-17-3P 表達的調控作用尚不明確。為此，本研究重點探討莪術醇對肝癌miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P 和miR-17-3P 表達的影響，從microRNAs 角度揭示莪術醇抗肝癌的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肝癌細胞株HepG2 購于江陰齊氏生物科技有限公司，莪術醇購于北京索萊寶科技有限公司（IC0620），miRcute miRNA isolation kit 購于天根生物科技有限公司（Cat# DP501），氯仿購于天津市永大化學試劑有限公司，無水乙醇購于天津市永大化學試劑有限公司，DEPC 水購于北京索萊寶科技有限公司，miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 購于天根生物科技有限公司（Cat#KR201），miRcute miRNA Detection Kit（SYBR Green）購于天根生物科技有限公司（Cat# FP401），DMSO 購于Amresco（Cat#D8370）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取人肝癌細胞株HepG2，于DNEM培養基（含10%胎牛血清、10 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素）中，置室溫37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測莪術醇對miR-17、miR-130 和miR-24、miR-629 表達的影響 將培養的HepG2 接種至培養瓶內，3 瓶/組，密度為4×104個/ml，待細胞生長良好，將其分為對照組、不同濃度莪術醇藥物組。莪術醇（50、100 μg/ml，少量DMSO 溶解）藥物組換入含莪術醇的培養液干預，對照組予少量DMSO，作用48 h 后，提取各組總RNA：加入Trizol試劑，加入氯仿，離心分離，加入異丙醇，離心，乙醇洗滌沉淀，離心，分離白色RNA 沉淀，分光光度計檢測RNA 純度、濃度，特異性逆轉目的miRNA，合成相應cDNA，熒光定量PCR 儀檢測分析。miR-629-3P、miR-24-1-3P、miR-130a-5P、miR-17-3P 和U6引物序列如下：miR629 -3P：foward 5'TTCTCCCAACGTAAGCCCAGC 3'；miR24 -1 -3P：forward 5'TGGCTCAGTTCAGCAGGAACA 3'；miR130a -5P：forward 5'GCTCTTTTCACATTGTGCTACT 3'；miR17-3P：foward 5'CTGCAGTGAAGGCACTTGTAG 3'；U6（內參）：foward 5'CTCGCTTCGGCAGCACA 3'。

1.3 統計學分析 采用GraphpadPrism 5.0 版軟件對數據進行分析。計量資料用（）表示，組間比較行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義，P＜0.01 表示統計學意義顯著，P＜0.001 表示統計學意義極顯著。

2 結果

兩個莪術醇藥物組中miR-130a-5P、miR-17-3P 的表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩個莪術醇藥物組中miR-629-3P、miR-24-1-3P 表達水平均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；50 μg/ml 莪術醇藥物組的miR-17-3P表達水平高于100 μg/ml 莪術醇藥物組，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩個莪術醇藥物組其余miRNAs 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 莪術醇調控肝細胞癌miRNAs 的表達

3 討論

目前，肝細胞癌的5 年生存率依舊較低[26]，其發病率和死亡率仍較高[1]。索拉菲尼是近年研制的抗肝癌新藥，雖對肝癌有一定療效，但昂貴的費用和嚴重不良反應使其應用受到限制。因此，關于肝細胞癌的保守替代療法還需要探索。不斷深入探索肝細胞癌的保守替代療法，尋找不良反應少甚至無毒副作用的藥物，提高肝細胞癌患者的生存質量，成為肝細胞癌治療研究的重點與難點。

目前認為，眾多基因和環境因子參與肝癌的發病。近年來，肝細胞癌的治療已經建立在miRNAs 的基礎上。miRNA 最初于2001 年被研究者從線蟲、果蠅及人體內發現。miRNA 是一種小型非編碼RNA分子，通過綁定目標mRNA 的3’未翻譯區（3′-untranslated regions，3′-UTRs）調節基因的表達。人類基因組編碼1000 多個miRNAs，超過50%的細胞mRNA 受miRNA 調控。miRNA 對細胞有諸多作用，包括細胞增殖、分化、凋亡和應激反應等有重要調控作用。越來越多的研究報道[27]，miRNAs 通過調控基因表達，使其在諸多癌癥如肺癌、結腸癌、骨癌、乳腺癌和肝癌等進展中占據關鍵地位，而miRNAs 在肝臟疾病和肝癌組織中異常表達。這些研究將為用于肝癌早期診斷生物標記物的開發提供可能[28，29]。有研究報道[30]，miRNA 通過改變免疫微循環，反轉免疫耐受，壯大抑制腫瘤的免疫性應答。以往研究證實[31-34]，多種miRAN 在肝癌組織或細胞中反常表達，這些miRANs 是調控肝癌發生、發展的重要因素之一，將逐步成為肝癌治療的新靶點。

在中醫古籍上，肝癌并無對應病名，但相似癥狀、體征卻早有記載。《素問·腹中論》曰：“有病心腹滿，旦食不能暮食，此為何病？對曰：名鼓脹”。《圣濟總錄》：“積氣在腹中，久不瘥，牢固推之不移者，癥也……按之其狀如杯盤牢結，久不已，令人身瘦而腹大，致死不消。”肝癌當屬中醫癥瘕、積聚、黃疸等病癥范疇。中醫學認為，莪術具有祛瘀破血，行氣止痛的功效。《日華子本草》言：“治一切氣滯……消瘀血，止撲損痛，下血及內損惡血等。”以往研究報道莪術具有抗腫瘤[35-37]、抗肝癌[38-40]的作用。莪術的破血消積，行氣止痛功用，對應主治癥瘕、積聚、心腹滿痛等病癥。無論是從現代藥理研究還是從民族醫藥文獻資料記載來看，莪術都具有明顯的保肝抗炎、抑制肝癌的作用。莪術含有豐富的揮發油，該揮發油中具有多種活性成分，莪術醇是其主要活性成分之一，屬倍半萜烯類物質。莪術醇作為中藥莪術的主要有效成分，歷年《中國藥典》均將莪術醇的含量列為莪術質量監控的標準。越來越多的研究報道，莪術醇具有顯著抑制肝癌作用，通過抑制細胞周期蛋白基因的表達，阻斷肝癌細胞周期G1期發揮誘導肝癌細胞發生凋亡及抑制其增殖的作用[23,41-44]。

研究顯示，miR-629、miR-24 在肝細胞癌中表達明顯升高[24]，miR-130a[25]在肝細胞癌中表達下降，miR-17-3P 與肝癌發生及發展密切相關[45]。本研究發現，miR-629、miR-24 在肝癌HepG2 細胞中在治療前為高表達，與以往研究報道一致[24]，莪術醇作用后其表達下調。miR-130a 及miR-17-3P 在腫瘤中的作用尚存在爭議。有研究顯示，miR-130a 在肝癌組織中低表達[25]，也有研究顯示其可在肝癌細胞中的表達較正常細胞高[46]。同時，有研究顯示，miR-17-3P 有抑制腫瘤作用[47]，亦有研究顯示其促進腫瘤發展[45]。本研究結果顯示，miR-130a、miR-17-3P在肝癌HepG2 細胞中在治療前為低表達，莪術醇作用后能上調miR-130a、miR-17-3P 的表達。

綜上所述，莪術醇可能通過上調miR-130a、miR-17-3P 的表達，下調miR-629、miR-24 的表達，發揮抗肝癌的作用。