盲肌樣蛋白1（MBNL1）對(duì)血小板衍生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用研究

安 潔，信栓力，劉吉祥，常 超，趙秀峰，鄭 杰，連晶晶

（邯鄲市第一醫(yī)院心內(nèi)一科1，神外一科2，河北 邯鄲 056002）

血管壁由外膜、中膜及內(nèi)膜構(gòu)成，其中血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）占據(jù)的比例最高。在正常血管中，VSMCs 主要發(fā)揮收縮舒張功能，表現(xiàn)為收縮表型，在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程及某些病理狀態(tài)下，細(xì)胞受到各種生化因子、機(jī)械刺激、細(xì)胞外基質(zhì)組分改變等因素的影響，伴隨著α-SMA、SM-MHC 等收縮基因表達(dá)下調(diào)、細(xì)胞過(guò)度增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多等一系列細(xì)胞特性改變[1]，VSMCs 發(fā)生細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化[2]。VSMCs 表型轉(zhuǎn)換既是對(duì)刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)，也參與了多種心血管疾病的發(fā)病過(guò)程，但其具體機(jī)制目前尚不完全明確，有待進(jìn)一步闡明。MBNL1 屬于盲肌樣蛋白家族，是一種重要的RNA 結(jié)合蛋白，主要功能是調(diào)控多種前體mRNA 的選擇性剪接[3]、調(diào)控mRNA 運(yùn)輸及定位[4]。選擇性剪接是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，經(jīng)選擇性剪接可以產(chǎn)生同一基因的不同蛋白異構(gòu)體，進(jìn)而發(fā)揮不同生物作用。MBNL1 的缺失是強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)病機(jī)制之一[5，6]，提示MBNL1 對(duì)于肌源性細(xì)胞的發(fā)育分化起著至關(guān)重要的作用。既往研究表明MBNL1 可以調(diào)控骨骼肌及心肌的分化發(fā)育及病理過(guò)程的發(fā)生[5-8]。然而關(guān)于MBNL1 在血管平滑肌中的研究較少。因此，本研究旨在觀察MBNL1 在VSMCs 表型轉(zhuǎn)換中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 雄性SD 大鼠，體重150～200 g，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，提供12 h 光照，食水充足，所有實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定；DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA 購(gòu)于吉諾生物公司；胎牛血清購(gòu)于Bioind 公司；BCA 試劑盒、PVDF 膜、Alexa Fluor594標(biāo)記抗小鼠IgG抗體、Lipofectamine 2000 購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；Ⅱ型膠原酶、彈力蛋白酶購(gòu)于Worthington 公司；大鼠PDGF-bb 購(gòu)于金斯瑞生物公司；抗-MBNL1 抗體、抗-a-sma 抗體、抗-a-tubulin 抗體、HRP 偶聯(lián)抗兔IgG 抗體、HRP 偶聯(lián)抗鼠IgG 抗體購(gòu)于三鷹生物公司；siRNA 購(gòu)于銳博生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠血管平滑肌原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 選取150～200 g 雄性SD 大鼠，腹腔麻醉處死，酒精消毒后置于無(wú)菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)內(nèi)，開(kāi)胸分離胸主動(dòng)脈，剝離結(jié)締組織，用PBS 清洗血污后，放入濃度3 mg/ml 的Ⅱ型膠原酶中，37 ℃酶消10～15 min。剝?nèi)パ芡饽ぃ瑢⒀芗魹? mm2大小組織塊，加入3 mg/ml 的Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化0.5 h。再加入等體積濃度1 mg/ml的彈力蛋白酶,37 ℃消化1.5 h 左右，加入血清終止消化，小心吹散組織塊，離心后即可獲得原代細(xì)胞。將細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)基箱中，每2～3 d 換液，細(xì)胞匯和度達(dá)90%進(jìn)行傳代。選用第3～8 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 將大鼠VSMCs 接種于96 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)30%～40%進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗后加入4%多聚甲醛，室溫下固定細(xì)胞15 min，隨后PBS 清洗3 次。加入0.5%Triton-X-100 室溫下通透10 min，用PBST 清洗3次。加入1% BSA 室溫下封閉0.5 h。加入一抗（稀釋濃度為1∶200），4 ℃放置約12 h，PBST 清洗3 次。加入二抗（稀釋濃度為1∶500），室溫下避光放置1～2 h，PBST 清洗3 次。加入DAPI 溶液染核，室溫下避光放置10 min，PBST 清洗3 次，觀察并拍照。

1.2.3 PDGF-bb 刺激實(shí)驗(yàn)及分組 將大鼠VSMCs 接種于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞匯合度達(dá)70%，棄去完全培養(yǎng)基，加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓24 h，再次更換無(wú)血清的培養(yǎng)基，對(duì)照組加入PBS，其他各組加入PDGF-bb，終濃度分別為10、20、40、80 ng/ml，48 h 后提取總蛋白。

1.2.4 siRNA 轉(zhuǎn)染 將大鼠VSMCs 接種于12 孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，使用Lipofectamine 2000 按照說(shuō)明書分別轉(zhuǎn)染siRNA-nc 及siRNA-mbnl1，siRNA-mbnl1 序 列如下:siRNA -1 GCTGCTGCACAGAAGTTAA,siRNA -2 GGTCGTTGCTCCAGAGAAA,siRNA-2 GCACAATGATTGATACCAA。6 h 后棄去培養(yǎng)液，更換為含10%血清培養(yǎng)基，24 h 后獲取細(xì)胞用于遷移實(shí)驗(yàn)，48 h 后提取總蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞慢病毒感染 將大鼠VSMCs 接種于12 孔板，待細(xì)胞匯合度60%～70%，更換培養(yǎng)基并加入慢病毒，24 h 后換液，48 h 后獲取細(xì)胞用于遷移實(shí)驗(yàn)，72 h 后提取總蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 蛋白免疫印跡 使用RIPA 裂解液提取蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取蛋白30 μg，加入5×loadingbuffer 配置為20 μl 體系，99 ℃變性10 min。將SDS-PAGE 凝膠放入電泳液中，加入marker 及蛋白樣本于凝膠孔中，起初以80 V 恒壓電泳，當(dāng)?shù)鞍椎竭_(dá)分離膠，調(diào)整電壓至100 V 繼續(xù)電泳至底。將凝膠切下轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜液，置于冰水混合物中，以300 mA 恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5%牛奶封閉液室溫下封閉2 h，PBST 洗膜后，加入一抗（按1∶1000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；PBST 洗膜3 次，加入二抗（按1∶2000 稀釋），室溫下孵育2 h。PBST 洗膜3 次，用ECL 發(fā)光液澆膜進(jìn)行顯影。

1.2.7 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以基質(zhì)膠包被基底膜下室側(cè)，并制備Lv-nc 組、Lv-mbnl1 組、siRNA-nc 組、siRNA-mbnl1 組細(xì)胞懸液。對(duì)照組下室中為完全培養(yǎng)基，刺激組下室中為含PDGF-bb 完全培養(yǎng)基，濃度為20 ng/ml。在上室中加入細(xì)胞液，每孔含細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)，培養(yǎng)12 h。取出Transwell 小室，用PBS充分浸泡基底膜，并置于結(jié)晶紫溶液中染色15 min，用PBS 浸泡3 遍，用棉簽擦掉基底膜上側(cè)細(xì)胞，進(jìn)行觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血管平滑肌原代細(xì)胞鑒定 對(duì)大鼠血管平滑肌原代細(xì)胞進(jìn)行觀察，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)為紡錘狀，并呈典型峰谷樣生長(zhǎng)。對(duì)α-SMA 進(jìn)行免疫熒光染色見(jiàn)圖1，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度在98%以上。

圖1 大鼠血管平滑肌原代細(xì)胞免疫熒光鑒定

2.2 PDGF-bb 刺激大鼠VSMCs 后MBNL1 表達(dá) 給予VSMCs 不同濃度的PDGF-bb，α-SMA 蛋白表達(dá)下調(diào)呈現(xiàn)濃度依賴性，提示細(xì)胞模型造模成功；10、20、40、80 ng/ml 濃度刺激下MBNL1 蛋白表達(dá)量分別為（1.35±0.09）、（1.67±0.19）、（1.64±0.12）、（1.54±0.33），與對(duì)照組比較均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中以20 ng/ml 最為顯著，見(jiàn)圖2。

圖2 Western blot 檢測(cè)不同濃度PDGF-bb 刺激下MBNL1 表達(dá)量變化

2.3 MBNL1 敲低及過(guò)表達(dá)效率檢測(cè) 采用慢病毒過(guò)表達(dá)MBNL1，結(jié)果提示Lv-mbnl1 組較Lv-nc 組蛋白表達(dá)量顯著增加，見(jiàn)圖3A。分別以siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，siRNA-2 敲低效果最為明顯，見(jiàn)圖3B，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA-2 進(jìn)行。

圖3 Western blot 檢測(cè)過(guò)表達(dá)及敲低效率

2.4 MBNL1 抑制大鼠VSMCs 遷移 分別在細(xì)胞水平過(guò)表達(dá)、敲低MBNL1，24 h 后進(jìn)行Tranwell 遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Lv-mbnl1 組細(xì)胞遷移數(shù)為（0.86±0.07），少于Lv-nc 組（1），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Lv-mbnl1+PDGF-bb 組細(xì)胞遷移數(shù)為（3.36±0.25），少與Lv-nc+PDGF-bb 組的（4.21±0.27），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4A、4C；siRNAmbnl1 組細(xì)胞遷移數(shù)為（1.82±0.12），較siRNA-nc組（1）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siRNAmbnl1+PDGF-bb 組細(xì)胞遷移數(shù)為（3.30±0.38），較siRNA-nc+PDGF-bb 組的（2.35±0.14）增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4B、4D。

圖4 MBNL1 抑制大鼠VSMCs 遷移

3 討論

我國(guó)心血管疾病死亡率高居首位,探究心血管疾病的發(fā)病機(jī)制是疾病的預(yù)防及治療的重要內(nèi)容。血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白[9]、細(xì)胞周期蛋白[10]、收縮蛋白[11]、離子通道[12]等均存在選擇性剪接調(diào)控，通過(guò)產(chǎn)生不同的蛋白異構(gòu)體使細(xì)胞表型發(fā)生改變。MBNL1 作為一種廣泛存在于各種細(xì)胞中的RNA 結(jié)合蛋白，近期被證實(shí)，參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞分化，這一作用通過(guò)影響血清反應(yīng)因子（SRF）前體mRNA 的選擇性剪接實(shí)現(xiàn)[13]。另一項(xiàng)研究表明[8]，MBNL1 參與異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大過(guò)程，其機(jī)制為MBNL1 調(diào)控Myocardin 選擇性剪接。SRF 是VSMCs 維持收縮表型的至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)識(shí)別基因中的特定序列，啟動(dòng)下游標(biāo)記性基因轉(zhuǎn)錄。SRF 廣泛存在于多種細(xì)胞中，但其調(diào)控的收縮基因僅在平滑肌中高表達(dá)，這與轉(zhuǎn)錄共激活因子Myocardin 密切相關(guān)[14，15]。MBNL1 可以調(diào)控SRF 及Myocardin 選擇性剪接，由此推測(cè)MBNL1 可能是血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮作用的重要分子。

本研究表明在細(xì)胞水平誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)換模型，在各個(gè)濃度下MBNL1 表達(dá)水平上升，說(shuō)明MBNL1 與VSMCs 表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。Woo CC 等[16]研究證實(shí)在人VSMCs 中，MBNL1 上調(diào)Myh11 等收縮基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。Li Y 等[17]研究表明在脂質(zhì)、炎癥因子等刺激下，MBNL1 表達(dá)下調(diào)引起VSMCs 巨噬細(xì)胞化，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。但是MBNL1對(duì)于VSMCs 遷移能力的影響尚無(wú)報(bào)道。Chen J 等[18]研究證明MBNL1 可以抑制鱗狀上皮癌細(xì)胞遷移，推測(cè)在平滑肌中可能有相似作用。為了進(jìn)一步探究其對(duì)VSMCs 遷移能力的影響，在細(xì)胞水平對(duì)MBNL1 進(jìn)行了過(guò)表達(dá)和敲低，隨后檢測(cè)了細(xì)胞的遷移能力。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)MBNL1 可以抑制細(xì)胞遷移，但這種抑制作用在正常細(xì)胞中并不明顯，僅在PDGF-bb 誘導(dǎo)的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中作用較為明顯，這提示MBNL1 表達(dá)上升是對(duì)刺激的一種反饋性保護(hù)作用。而敲低MBNL1，不論有無(wú)PDGF-bb 作用，均能增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，說(shuō)明MBNL1 對(duì)VSMCs收縮表型的維持不可或缺。綜合以上結(jié)果，得出MBNL1 抑制VSMCs 發(fā)生細(xì)胞遷移，進(jìn)而對(duì)血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換起到抑制作用。在PDGF-bb 誘導(dǎo)下MBNL1 表達(dá)上調(diào)是一種反饋性保護(hù)機(jī)制。

關(guān)于MBNL1 減弱VSMCs 遷移能力的具體機(jī)制還尚不明確，有期待進(jìn)一步探究。伴隨著VSMCs骨架蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)的改變，細(xì)胞遷移能力隨之改變。骨架蛋白及外基質(zhì)改變過(guò)程涉及到一些關(guān)鍵蛋白，如膠原蛋白I（Collagen I）[19]，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）[20]等。MBNL1 可能通過(guò)調(diào)控這些重要蛋白的選擇性剪接，對(duì)VSMCs 遷移能力產(chǎn)生影響，將在下一步實(shí)驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

綜上所述，MBNL1 抑制VSMCs 遷移，進(jìn)而影響血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換，這可能會(huì)成為多種心血管疾病防治的新靶點(diǎn)。