雞蛋中泰妙菌素化學發光酶免疫分析方法研究

李 露，楊金易，王 宇，張 政，苑婷婷，肖毅美，徐振林，沈玉棟*

（1.華南農業大學 食品學院 廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 510410；3.深圳凱吉星農產品檢測認證有限公司，廣東 深圳 518000）

泰妙菌素（Tiamulin，TML，圖1）又名泰妙靈，是一種截短側耳素類抗生素［1-2］，具有和大環內酯類相似的抗菌能力，對細菌、支原體、螺旋體和霉形體等均有良好的抑菌效果［3-4］，常用于治療雞的慢性呼吸道疾病、豬的瘧疾和支原體引起的各種畜禽疾病［5］。然而，泰妙菌素通過食物鏈富集于人體內可能會增加患癌風險，導致胚胎畸性或突變的情況發生，對人類健康造成潛在危害［6-7］。我國2019 年發布的GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中明確規定泰妙菌素在雞蛋中的殘留限量為1 mg/kg［8］。蛋類是非常優質的、人們日常大量消費的高營養食品，不少商家為提高養殖收益，過量、頻繁或不遵守休藥期違規使用泰妙菌素進行養殖，造成殘留超標問題突出［9］，威脅著人們的身體健康。因此，開發靈敏、準確且快速的篩查方法對監管雞蛋中泰妙菌素的殘留至關重要。

圖1 泰妙菌素及其半抗原泰妙菌素肟（TMLO）結構Fig.1 The structures of tiamulin and hapten TMLO

目前，針對泰妙菌素殘留的檢測方法以色譜-質譜聯用等大型儀器確證技術為主［10-12］，這些方法可準確地對藥物進行定量檢測，靈敏度高、檢測結果可靠，但是前處理復雜，耗時耗力，操作專業性強，難以實現高通量現場篩查。免疫分析方法相比于儀器法具有前處理過程簡單、檢測時間短、成本低、樣品通量高等優點，與大型儀器確證方法優勢互補，可顯著提高畜禽產品及飼料獸藥殘留的檢測效率［13-15］。化學發光酶免疫分析方法（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA），是以魯米諾等化學發光底物為信號探針模式發展起來的超靈敏免疫分析技術［16］，其原理主要是通過辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）催化H2O2釋放出活性氧，氧化誘導底物魯米諾為激發態，當其電子從激發態躍遷回基態時，釋放出光子信號進行檢測。該法具有靈敏度高、無背景化學發光信號干擾等突出優勢［17］，已在醫療診斷、環境與食品安全檢測領域得到廣泛應用與發展［18-19］。目前，針對食品中泰妙菌素殘留的CLEIA 方法未見報道。因此，本研究擬通過半抗原設計合成、動物免疫與細胞融合技術制備高質量抗泰妙菌素單克隆抗體，并結合魯米諾底物化學發光信號探針建立快速檢測泰妙菌素的CLEIA方法，旨在為食品安全監管提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SpectraMax I3x連續波長多功能微孔板檢測儀（美國Molecular Devices 公司）；AB SCIEX 5500三重四極桿質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；EYELA 旋轉蒸發儀（上海愛郎儀器有限公司）；U3010 微量紫外可見分光光度儀（美國Thermo 公司）；超低溫高速離心機（美國Eppenndorf 公司）；DEM-3 型自動洗板機（北京拓普分析儀器有限責任公司）；82-5 控溫磁力攪拌器（金壇市恒豐儀器廠）；TC-2323 CO2培養箱（美國Shellab公司）；CHA倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

泰妙菌素、羅紅霉素、卡那霉素、恩諾沙星等標準品及N，N-二甲基甲酰胺（上海阿拉丁試劑公司）；乳鐵蛋白（LF）、雞卵清白蛋白（OVA）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、二環己基碳亞二胺（DCC）、Freund完全佐劑與不完全佐劑、HRP標記的羊抗鼠IgG抗體（美國Sigma公司）；化學發光底物液、化學發光增強液（廣州萬聯生物技術有限公司）；其它化學試劑均為國產分析純。RPMI-1640 培養基（美國Gibco公司）；小鼠骨髓瘤SP2/0（本實驗室保存）；SPF級Balb/c雌性小鼠（廣東省醫學實驗動物中心）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原的制備與鑒定 參考文獻［20］，利用TML 分子中的羰基與NHS 縮合形成羧甲基羥肟手臂的半抗原泰妙菌素肟（TMLO）（圖1）。然后，采用活潑酯法［21］將半抗原TMLO 與OVA 載體蛋白偶聯為包被原TMLO-OVA，與LF 偶聯為免疫原TMLO-LF，并用紫外吸收光譜掃描載體蛋白、半抗原和人工抗原，以鑒定人工抗原是否合成成功［22］。

1.2.2 單克隆抗體的制備與評價 參考文獻［23］，使用免疫原TMLO-LF 平行免疫3 只健康適齡（6～8周齡左右）的Balb/c雌性小鼠，3次免疫后一周對小鼠尾靜脈采血，取抗血清上清進行效價和抑制檢測，選用免疫應答最好的小鼠進行融合［24-25］，通過亞克隆篩選獲得單克隆細胞株，并經小鼠腹腔注射培養獲得腹水，最后采用蛋白G（Protein G）親和層析純化后保存至-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 CLEIA 方法的建立 參考文獻方法［26］，采用棋盤法選擇合適的包被原濃度和抗體稀釋倍數組合進行抑制曲線繪制，并根據IC50確定最佳包被原質量濃度與抗體質量濃度；然后，采用單因素實驗優化藥物和抗體稀釋液（含吐溫-20 的磷酸緩沖液（PBST）、磷酸緩沖液（PBS）、一級水）、反應緩沖溶液PBS離子濃度（0.005、0.01、0.02 mol/L）、酶標二抗稀釋液（PBS、PBST、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液Tris-HCl）、酶標二抗質量濃度（3.33、2.50、2、1.67 μg/mL）及反應時間（20、30、40、50 min）等影響因素。最佳反應條件應具備適當的化學發光值（RLU0）、較低的IC50和較高的RLU0/IC50比值。RLU0/IC50越高，IC50越低，則靈敏度越高，綜合最佳反應條件建立泰妙菌素標準曲線，其中，縱坐標B表示添加泰妙菌素時的化學發光值、B0表示未添加泰妙菌素時的化學發光值，橫坐標為靶標藥物質量濃度。

1.2.4 抗體的特異性 選取泰妙菌素常見結構或功能類似物氧氟沙星、氟羅沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、羅紅霉素、卡那霉素和克拉霉素標準品測定IC50，按以下公式計算交叉反應率（CRs）：CRs（%）=［IC50（泰妙菌素）/IC50（類似物）］×100。

1.2.5 加標回收實驗 雞蛋樣品前處理步驟：稱取2.0 g 均質后的空白樣品置于離心管中，加入2 mL 提取液（pH 7.4 的PBS 與甲醇等體積混合液），渦旋混合5 min 后振蕩30 min。以10 000 r/min 離心10 min，取上層清液稀釋。

采用上述樣品前處理方法處理并消除基質干擾后進行加標回收實驗，向陰性的實際樣品中添加高、中、低3種濃度的待測藥物，每個濃度做3組平行，計算加標回收率。

1.2.6 儀器確證方法比對 參考我國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T 4584-2016［27］的樣品前處理方法進行處理，測定實際雞蛋樣品，將測定結果與所建立的CLEIA方法結果進行比對。

2 結果與討論

2.1 人工抗原的制備與鑒定

分子的組成與空間構型不同，在紫外區的光譜也不同。半抗原成功偶聯載體蛋白后，分子間通過共價鍵產生共軛與電子轉移，導致峰形或位置發生一定變化，可根據該原則判斷人工抗原是否偶聯成功。UV-Vis 圖譜顯示（圖2），在200～400 nm 的紫外波長范圍內，載體蛋白LF 和OVA 在218 nm 和280 nm 左右分別有強弱兩個特征吸收峰，偶聯半抗原TMLO 后的抗原TMLO-LF和TMLO-OVA 在250～300 nm 之間的峰形與載體蛋白LF 和OVA 顯著不同，說明人工抗原合成成功。另外，“2.2”部分的免疫抗血清評價產生的泰妙菌素的特異性抑制與識別也間接證明抗原合成成功。

圖2 泰妙菌素半抗原、載體蛋白和人工抗原的紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet scanning of haptens，carrier protein and synthesized antigens

2.2 抗血清評價與單克隆抗體制備

抗血清評價結果顯示，藥物質量濃度為1 μg/mL、包被原質量濃度為1 μg/mL 時，TMLO-LF 免疫原免疫的2號小鼠抗血清效價為8 k，抑制率為88.3%，效價和抑制率最高，說明該抗血清的親和力好、識別泰妙菌素的能力高，可用于后續單克隆抗體的制備。小鼠進行細胞融合后，經有限稀釋得到細胞上清效價/抑制率為10/95.8%的陽性株，通過細胞體外培養制備腹水，再純化后得到抗體。

2.3 標準曲線的建立

通過優化實驗得到CLEIA 方法的最佳實驗條件為：包被原質量濃度0.26 μg/mL，抗體質量濃度為0.94 μg/mL，反應緩沖體系為0.02 mol/L的PBS（pH 7.4），酶標二抗稀釋液為PBST，酶標二抗質量濃度為2 μg/mL，酶標二抗反應時間為40 min。在該條件下，建立了泰妙菌素的CLEIA 方法，檢出限（LOD，IC10）為0.03 ng/mL，IC50為0.54 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～IC80）為0.17～1.74 ng/mL（圖3）。另外，與酶聯免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金免疫層析法（Gold immunochromatographic assay，GICA）相比，本方法具有更高的靈敏度（表1）。

圖3 CLEIA的標準曲線（n=3）Fig.3 Dose-response curve for tiamulin by CLEIA（n=3）

表1 泰妙菌素檢測方法比較Table 1 Comparation of the determination methods for tiamulin

2.4 特異性分析

以交叉反應（CR）為指標，考察了泰妙菌素與其結構功能類似物的特異性，發現其與類似物不存在明顯交叉反應（表2），說明本研究建立的CLEIA方法對泰妙菌素具有良好特異性。

表2 與結構類似物的交叉反應(n=3)Table 2 Cross reactions with tiamulin analogues（n=3）

（續表2）

2.5 基質效應消除

雞蛋樣品經“1.2.5”方法前處理后，以PBS稀釋25倍的提取液所繪制的CLEIA標準曲線與用PBS所繪制的標準曲線基本吻合，說明基本消除了基質對CLEIA 的干擾。因此，在加標回收實驗中，雞蛋樣品經前處理后以PBS稀釋25倍用于CLEIA檢測。

2.6 樣品加標回收實驗及方法比對

選擇雞蛋陰性空白樣品，添加低、中、高3 個濃度水平的泰妙菌素標準溶液，經相應的樣品前處理后分別用CLEIA 方法和HPLC-MS/MS方法［27］檢測，并計算其回收率和相對標準偏差（RSD）。每個樣品測定3 次，取平均值，結果如表3 所示。CLEIA 方法的平均加標回收率為100%～118%。RSD 均小于10%。與HPLC-MS/MS 檢測結果的相關性良好，回歸方程為y=0.91x+3.68，r2為0.998 7。說明方法準確度良好，適用于雞蛋樣品中泰妙菌素的檢測。

表3 泰妙菌素樣品加標回收實驗（n=3）Table 3 Spiked recoveries of tiamulin in blank samples（n=3）

3 結 論

本研究基于羧甲基羥肟為偶聯手臂的半抗原TMLO，通過動物免疫、細胞融合篩選等獲得了泰妙菌素特異性單克隆抗體，并建立了雞蛋中泰妙菌素殘留的CLEIA 檢測方法。該方法對泰妙菌素的LOD 為0.03 ng/mL，IC50為0.54 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～IC80）為0.17～1.74 ng/mL。與其功能結構類似物無交叉反應，特異性良好。實際樣本加標回收率為100%～118%，RSD 小于10%，與HPLC-MS/MS 方法的檢測結果相關性良好（r2= 0.998 7），適用于雞蛋樣品中泰妙菌素殘留的快速篩查檢測。