卡貝縮宮素注射液容器密封性方法學驗證

姚 振，盧志明，余濤濤，楊 靖

（杭州澳亞生物技術股份有限公司，浙江 杭州 310018）

卡貝縮宮素是一種合成的具有激動劑性質的長效九肽類似物，通過與子宮平滑肌的催產素受體結合，促使子宮平滑肌收縮壓迫子宮肌層血管，從而達到止血目的，臨床用于子宮收縮乏力和產后出血［1?2］。無菌產品的容器密封系統須能防止微生物侵入，但目前國內鮮有報道注射劑容器密封性的研究。2020年10月21日，國家藥品監督管理局藥品審評中心發布了《化學藥品注射劑包裝系統密封性研究技術指南（試行）》（簡稱《指南》），要求注射劑應根據產品特點開展包裝系統密封性研究，且其密封性測試方法應經過驗證［3］。由于無菌檢查不足以說明注射劑包裝系統密封的完整性，應進行容器密封性驗證，并需對方法的靈敏度加以考察。本研究中參考文獻［3?4］，采用色水法（亞甲基藍溶液法）對卡貝縮宮素注射液容器的密封性進行方法學驗證。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XSE205DU型電子天平（梅特勒?托利多儀器<上海>有限公司，精度為0.01 mg）；MFY?05S型密封性測試儀（濟南三泉中石實驗儀器有限公司）；YB?2型澄明度檢測儀（天大天發科技有限公司）；UV?2600型紫外可見分光光度計（島津儀器<蘇州>有限公司）。

1.2 試藥

卡貝縮宮素注射液（杭州澳亞生物技術股份有限公司，批號為19060211，規格為每支1 mL∶100 μg）；亞甲基藍三水合物（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20190625，生物染色劑級別）。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 目視觀察法比較溶液顏色

溶液制備：取亞甲基藍三水合物10 g，加100 mL水溶解，混勻，即得10%亞甲基藍溶液。取樣品10支，倒置，放入含有10%亞甲基藍溶液的容器中，置密封性測試儀中，抽真空至真空度為25 kPa，維持30 min，將真空裝置恢復至常壓，再放置30 min，取出，用水沖洗瓶外壁，即得供試品溶液。取亞甲基藍三水合物適量，精密稱定，用水溶解并稀釋成每1 mL中含有0.5μg的溶液，即得亞甲基藍對照溶液（相當于每支樣品能檢測到0.005μL泄漏體積的10%亞甲基藍溶液）。

方法：取供試品溶液與亞甲基藍對照溶液，在澄明度檢測儀下觀察，供試品溶液顏色均不得比亞甲基藍對照溶液更深。

2.1.2 紫外?可見分光光度（UV?Vis）法測定吸光度

溶液制備：操作同2.1.1項下“取亞甲基藍三水合物10 g……用水沖洗瓶外壁”，開啟西林瓶，移取0.5 mL，置20 mL容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液。取亞甲基藍三水合物20 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，即得質量濃度為0.2 mg/mL的亞甲基藍貯備液。取樣品1支，加入亞甲基藍貯備液50μL，混勻，取0.5 mL，置20 mL容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，即得陽性對照溶液（相當于每支樣品能檢測到0.1μL泄漏體積的10%亞甲基藍溶液）。

方法：以水作為空白溶劑，取供試品溶液和陽性對照溶液各適量，照UV?Vis法［5］，于最大波長處測定吸光度，供試品溶液測定的吸光度值應不大于陽性對照溶液的吸光度值。

2.2 方法學驗證

2.2.1 最大吸收波長選擇

取亞甲基藍三水合物50.45 mg，精密稱定，逐級稀釋，即得質量濃度為0.005 mg/mL的亞甲基藍溶液。以水作為空白溶劑，將上述亞甲基藍溶液置400～700 nm波長范圍內掃描，結果見圖1。可見，亞甲基藍于663.8 nm波長處有明顯吸收峰，吸光度為0.940。故選擇664 nm作為測定波長。

圖1 亞甲基藍溶液UV-Vis法掃描圖譜（400～700 nm）Fig.1 UV-Vis spectrogram of methylene blue solution（400-700 nm）

2.2.2 線性關系考察

取亞甲基藍三水合物50.45 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，即得質量濃度為1 mg/mL的亞甲基藍貯備液。精密量取亞甲基藍貯備液5 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.05 mg/mL的線性母液。將線性母液用水稀釋為質量濃度分別為0.126 1，0.252 3，0.504 5，0.630 6，1.261 0，2.523 0，5.045 0μg/mL的系列溶液，作為線性溶液。分別吸取線性溶液，以水作為空白對照，于664 nm波長處測定吸光度，以線性溶液的質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得線性回歸方程Y=0.189 3X?0.007（r=0.999 6，n=7），同時記錄各線性溶液的顏色。詳見表1。可見，亞甲基藍質量濃度在0.126 1～5.045 0μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好；各線性溶液的顏色隨質量濃度的增加由淺藍色變至深藍色，其中線性溶液1的顏色不易觀察（藍色極淺），故最終選擇線性溶液3作為對照溶液。

表1 亞甲基藍線性溶液吸光度與溶液顏色Tab.1 Absorbance of methylene blue linear solution and the solution color

2.2.3 檢測限確定

以線性溶液1的吸光度為指標進行考察，推測最低檢測限，配制相應溶液并檢測。根據最終確定的最低檢測限，按公式［能被檢測到的最低泄漏量（μL）=（C檢測限×V稀釋倍數）/C亞甲藍×1 000］推算出能被檢測到的最低泄漏量。采用UV?Vis法，根據線性最低濃度，結合樣品配制方法，計算得到能被檢測到的最低泄漏量為相當于每支樣品能檢測到0.05 μL泄漏體積的10%亞甲基藍溶液。采用目視觀察法確定能被檢測到的最低泄露量相當于每支樣品能檢測到0.005μL泄漏體積的10%亞甲基藍溶液。

2.2.4 專屬性試驗

目視觀察法比較溶液顏色：以水作為稀釋劑（空白溶劑）。取亞甲基藍三水合物100.012 3 g，精密稱定，置1 000 mL容量瓶中，用水溶解并定容，混勻，即得10%亞甲基藍溶液。取樣品1支，移取0.5 mL，置20 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，即得供試品溶液。取亞甲基藍三水合物20.1 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用水溶解并定容，搖勻，即得亞甲基藍貯備液a。精密量取亞甲基藍貯備液a 5 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，即得亞甲基藍貯備液b。精密量取亞甲基藍貯備液b 0.5 mL，置100 mL容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，即得亞甲基藍對照溶液。取樣品1支，加入亞甲基藍貯備液b 50μL，混勻，即得加樣供試品溶液。分別吸取上述3種溶液，按2.1.1項下目視觀察法觀察顏色，結果供試品溶液無色，亞甲基藍對照溶液可見藍色，加樣供試品溶液顏色不淺于亞甲基藍對照溶液，表明方法專屬性良好。

UV?Vis法：取樣品1支，加入目視觀察法中亞甲基藍貯備液a 50 μL，混勻，移取0.5 mL，置20 mL容量瓶中，用水稀釋并定容，搖勻，即得陽性對照溶液（相當于每支樣品能檢測到0.1μL泄漏體積的10%亞甲基藍溶液）。分別吸取目視觀察法中供試品溶液、陽性對照溶液，以水作為空白溶劑，于664 nm波長處測定吸光度，結果供試品溶液吸光度為?0.001，無紫外吸收；陽性對照溶液吸光度為0.030，高于線性溶液最低質量濃度的吸光度0.020。表明方法專屬性良好。

3 討論

紫外?可見分光光度計測定供試品溶液的吸光度時，供試品需稀釋40倍，而目視觀察法不經稀釋，直接目視觀察，操作簡便，專屬性和靈敏度均符合檢測要求，故最終選用目視觀察法比較溶液顏色，以判斷亞甲基藍溶液是否泄漏到樣品瓶。

化學藥品注射劑密封性檢查方法分為確定性方法和概率性方法兩大類，確定性方法是基于系列可預見的泄漏現象［6］。常用方法包括高壓放電法、質量提取法、壓力衰減法、真空衰減法［7?8］等；概率性方法包括微生物挑戰法、色水法、氣泡釋放法等，以及激光透射法［9］、近紅外光譜法［10］等。色水法要求供試品必須能承受浸沒，一般適用于液體制劑，常用的示蹤劑為10%亞甲基藍溶液，操作更簡單，成本更低廉，檢測周期更短［11］。卡貝縮宮素注射液為小容量注射液，其密封組件包括西林瓶、膠塞、鋁蓋，能耐受一定負壓，適合采用色水法檢測其密封性。但為滿足環保需求，色水法測試所用染色溶液須經適當處理后再排放，為可靠地清除染色物的殘留，還須不斷優化清潔方式［4］。容器密封系統和軋蓋參數會影響產品質量和容器密封性［12］，企業應根據注射劑自身特點和包裝特性，同時結合檢查方法的適用性和靈敏度，選擇適宜的密封性檢查方法［3］。