耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對抗菌藥物的耐藥研究

李翔，張利芳

（江蘇省蘇州市第九人民醫院，江蘇 蘇州 215200）

肺炎克雷伯菌（KP）是常見于人體呼吸道、消化道的革蘭陰性桿菌，也是醫院或社區獲得性感染的常見病原體［1?2］。碳青霉烯類抗菌藥物為治療KP的有效藥物，但臨床的不合理應用使耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）的檢出率逐年遞增［3］。本研究中探討了CRKP的耐藥方式，以提高碳青霉烯類抗菌藥物的臨床合理用藥水平。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：VITEK2?Compact型全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司），配有藥物敏感性（簡稱藥敏）試驗卡片；抗菌藥物紙片（英國Oxoid公司）；ABI7500型基因擴增儀（美國ABI公司）；HYDRASYS型蛋白電泳分析儀，C?880V型CO2孵箱，均購自美國Sebia公司；HC?2062型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；HulaMixer?Sample Mixe型渦旋混勻器（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

試藥：外排泵抑制劑PAβN（美國Sigma公司，批號為0001429016）；瓊脂糖（批號為D31018），引物（批號為B01019），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Mueller?Hinton瓊脂（MHA）藥敏試驗培養基（青島日水生物技術有限公司，批號為071123）；標志物DL 2000（批號為A1901B），Ex Taq DNA聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（批號為191148），均購自北京基尼亞生物技術有限公司；細菌蛋白抽提液（美國賽默飛世爾科技有限公司，批號為2191785）；肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706（批號為491227），大腸埃希菌ATCC 25922（批號為561229），銅綠假單胞菌ATCC 27853（批號為550106），均購自上海北諾生物科技有限公司；注射用美羅培南（日本住友商事株式會社，批號為201701023）；注射用亞胺培南（默沙東<中國>有限公司，批號為S012103）。

1.2 菌株來源

選取我院2017年1月至2020年12月收治的非重復性CRKP感染患者的耐藥菌株97株，分別編號為1?97號，均經VITEK2?Compact型全自動微生物分析儀分析確定對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。

1.3 藥敏試驗與細菌測定

采用VITEK2?Compact型全自動微生物分析儀對細菌進行鑒定和分類，并對抗菌藥物的敏感性進行初始檢測，操作步驟按儀器說明書進行。部分抗菌藥物無藥敏試驗卡片，參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）發布的《抗菌藥物敏感試驗執行標準第27版信息增刊》（簡稱《標準》）中Kirby?Bauer（K?B）法進行補充試驗，質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706、大腸埃希菌ATCC 25922與銅綠假單胞菌ATCC 27853［4］。

1.4 外排泵抑制試驗

參考《標準》中瓊脂稀釋法測定分離菌的最低抑菌濃度（MIC），分別測定添加及未添加外排泵抑制劑PAβN（終質量濃度為20 mg/L）的美羅培南和亞胺培南的MIC，兩者的測定質量濃度均為0.06～128.00 mg/L，每個質量濃度均接種10 000 cfu細菌。與未添加外排泵抑制劑PAβN相比，添加后的MIC提高4倍以上，即為細菌有外排泵機制［5］。

1.5 碳青霉烯酶篩選試驗

改良Hodge試驗：參考《標準》，將0.5麥氏濁度的致瀉性大腸埃希菌ATCC 25922用無菌生理鹽水稀釋10倍，均勻涂抹于瓊脂平板上，于中間位置貼放10 μg厄他培南紙片，接種環從紙片邊緣至平板外緣劃線接種待檢菌株，置35℃環境過夜培養。若次日厄他培南抑菌圈長出矢狀生長物，則視為待檢菌產碳青霉烯酶。

Carba NP試驗：取0.5%酚紅溶液2 mL，純水16.6 mL，10 mmol/L硫酸鋅溶液180 mL，置25～50 mL燒杯中，用10%鹽酸溶液或0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.7～7.9，作為A液；在A液中加入質量濃度為6 mg/mL的亞胺培南溶液（無菌注射用水配制），作為B液。取2支微量離心管，分別標記為a管和b管，均加入100μL細菌蛋白抽提液與1μL過夜培養的瓊脂平板接種環待測物，渦旋振蕩5 s，在a管中加入100μL A液，在b管中加入100 μL B液，渦旋，混勻，置35℃CO2孵箱中孵育2 h，每30 min查看并記錄顏色變化［6?7］。

1.6 PCR擴增和序列分析

采用煮沸法提取與純化細菌基因組DNA，以此為模板，采用PCR法擴增碳青霉烯酶［肺炎克雷伯菌產碳青霉烯酶（KPC）、AmpCβ?內酰胺酶（AmpC）類、新德里金屬β?內酰胺酶1（NDM?1）、超廣譜β?內酰胺酶（ESBLs）類］基因，即分別為blaKPC、blaAmpC類和blaNDM?1、blaESBls類。以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，經凝膠成像系統分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司專業人員測定擴增產物的序列，并同GenBank數據庫中的序列進行比對，以確認擴增的產物為靶基因片段及基因型［8］。

1.7 腸道細菌基因組重復序列（ERIC）-PCR同源性分析

引 物 序 列：ERIC1為5′?ATGTAAGCTCCT?GGGGATTCAC?3′，ERIC2為5′?AAGTAAGTGACT?GGGGTGAGCG?3′。擴增條件：95℃下預變性7 min，94℃下變性1 min，45℃下退火1 min，65℃下延伸4 min，30個循環；65℃下延伸16 min，1個循環；將擴增的產物放入1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳條件為電壓100 V，時間100 min，Tris硼酸電泳緩沖液（20倍稀釋）［9］。

2 結果

2.1 藥敏試驗

共分離出97株CRKP，且對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率均為100.00%；對氨基苷類、頭孢類、喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均超過85.00%；對四環素類抗菌藥物的耐藥率均低于25.00%。詳見圖1。

圖1 97株CRKP對臨床常用抗菌藥物的耐藥率Fig.1 Drug resistance rate of 97 CRKP strains to commonly used antibiotics in the clinic

2.2 碳青霉烯酶篩選試驗

93株CRKP的改良Hodge試驗和CarbaNP試驗結果均為陽性，陽性檢出率為95.88%；4株（編號分別為24，31，68，72號）CRKP的CarbaNP試驗結果為陽性，而改良的Hodge試驗結果為陰性；3株（編號分別為6，13，93號）CRKP的改良Hodge試驗及CarbaNP試驗結果均為陰性。

2.3 耐藥基因檢測結果

97株CRKP中，blaKPC的檢出率為89.69%（89/97），且均為blaKPC?2型酶；blaNDM?1的檢出率為71.13%（69/97）。blaESBLs類耐藥基因中，blaSHV，bla?TEM，blaCTX?M的檢出率分別為96.00%，77.00%，61.00%；blaAmpC類耐 藥基因中，blaDHA，blaFOX，blaCTT的檢出率分別為100.00%，87.00%，61.00%；未檢出blaAAC，blaEBC，blaGES，blaMOX，blaOXA?48，blaSME，blaVEB，blaVIM。blaKPC，blaNDM?1，blaTEM在CRKP耐藥基因中更具代表性［10］，其PCR擴增產物電泳圖見圖2。

M.Maker 1，4，7.陽性菌珠2，5，8.陰性對照3，6，9.陽性對照圖2 CRKP部分耐藥基因PCR擴增產物電泳結果M.Maker 1，4，7.Positive strains 2，5，8.Negative control 3，6，9 Positive controlFig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of partial drug resistance genes of CRKP

2.4 外排泵抑制試驗

9株CRKP（編號分別為3，18，25，30，39，58，75，86，94號）有細菌外排泵機制，提示主動外排泵參與了部分KP對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制，9株菌株耐藥基因的檢出率均大于85%。

2.5 ERIC-PCR基因分型

共發現9種類型的CRKP，參考文獻［11?12］，判斷各菌株的基因分型，其中1型42株，4型15株，5型14株，6型、8型各6株，2型、7型各4株，3型、9型各3株。部分耐藥菌株的ERIC?PCR基因分型見圖3。

3 討論

碳青霉烯類抗菌藥物在體內外均對革蘭陰性桿菌有抑制作用，是臨床治療KP的首選藥物，但隨著應用的增多，KP屬細菌對其耐藥的比例越來越高，部分治療多重耐藥KP感染有效的藥物（如亞胺培南、美羅培南等）已陸續出現耐藥現象，且呈不斷上升趨勢［7］。

本研究中從非重復性CRKP感染患者體內分離出97株CRKP，其在對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的同時，對氨基苷類等其他抗菌藥物亦有不同程度的耐藥。雖對四環素類抗菌藥物耐藥率較低，但該類抗菌藥物毒副作用較大，長期應用可對患者的消化、泌尿、血液、中樞神經等系統造成嚴重損害，并非為針對CRKP感染患者的首選藥物［13］。可見，CRKP作為一種高耐藥、高毒力的多重耐藥菌，其有效抗菌藥物的選擇范圍較窄。

CRKP最主要的耐藥機制為產生碳青霉烯酶［14］，水解青霉素類、頭孢類、碳青霉烯類等抗菌藥物。碳青霉烯酶在國內以KPC常見，也有耐亞胺培南（IPM）等。本研究中發現，CRKP感染患者存在多重耐藥基因積聚共存及外排泵抑制現象，與文獻［15?16］中提出的高產碳青霉烯酶（以KPC?2型酶為主），產AmpC酶伴外膜孔蛋白缺失或表達下調，主動外排泵系統異常活躍等導致革蘭陰性菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的論點類似。

M.Maker 1，7.1型2，3，6，9，10，12.2型4，5.3型8.4型11.5型圖3 CRKP部分耐藥菌株ERIC-PCR基因分型電泳結果M.Maker 1，7.Type 1 2，3，6，9，10，12.Type 2 4，5.Type 3 8.Type 4 11.Type 5Fig.3 Electrophoretogram of genotypes of ERIC-PCR of partial drug resistance strains of CRKP

本研究中采用改良的Hodge試驗與CarbaNP試驗檢測碳青霉烯酶表型，結果KPC?2型酶為CRKP產碳青霉烯酶的最主要亞型，這可能是導致CRKP對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制。KPC?2型酶具有單獨致碳青霉烯類抗菌藥物耐藥形成，而不依賴于外膜孔蛋白缺失的作用，加之其基因位于質粒轉座子上，經可轉移的70 kb質粒編碼，傳播高效［17］。ERIC?PCR同源性分析發現9種CRKP，其中1型為主要流行菌株，提示1型克隆株可能更易在本院流行傳播，醫務人員在嚴格規范使用抗菌藥物的基礎上，還應加大醫院感染防控力度。