膽固醇結(jié)石小鼠模型的研究進(jìn)展及致石飼料的設(shè)計(jì)應(yīng)用*

蘇永騰 葛全金 吳小馬

(1.江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司，南京 210000)(2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，南京 210095)

膽結(jié)石是一種常見(jiàn)的肝膽疾病[1]，在美國(guó)，12%的居民深受膽結(jié)石的危害和困擾，在歐洲，膽結(jié)石患者也超過(guò)了人群的10%，在中國(guó)等亞洲經(jīng)濟(jì)新興國(guó)家，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和飲食結(jié)構(gòu)的變化，膽結(jié)石患者也在逐年增加，患病率逐漸接近西方社會(huì)[2]。可見(jiàn)，這種古老而常見(jiàn)的疾病給全世界人類(lèi)的身體健康、社會(huì)經(jīng)濟(jì)、國(guó)家財(cái)政都帶來(lái)了嚴(yán)重的影響和負(fù)擔(dān)[2-3]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽固醇結(jié)石模型的建立對(duì)研究人類(lèi)結(jié)石的形成機(jī)制和對(duì)癥治療有著良好的指導(dǎo)意義，諸多文獻(xiàn)報(bào)道采用致石飼料可以誘導(dǎo)出小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膽固醇結(jié)石模型，但是報(bào)道的致石飼料配方之間有差異、造模成功率也程度不一，小鼠品系的選擇、造模初始周齡和造模周期等也因不同的研究目的而不同[4-7]。本文通過(guò)綜述小鼠膽結(jié)石造模的研究進(jìn)展以及致石飼料設(shè)計(jì)特點(diǎn)和應(yīng)用現(xiàn)狀，旨在為膽結(jié)石癥的研究工作提供借鑒。

1 膽固醇結(jié)石

1.1 膽結(jié)石的定義與分類(lèi)

膽結(jié)石又稱(chēng)為膽石癥，是一種常見(jiàn)的、發(fā)病率高的膽道系統(tǒng)發(fā)生結(jié)石并可能引起腹痛、黃疸、發(fā)熱等臨床癥狀的疾病[7]。膽結(jié)石的命名與分類(lèi)一般根據(jù)不同的成分、不同的成石部位等來(lái)進(jìn)行。結(jié)石的檢測(cè)方法一般有X線衍射分析法、磁共振譜(HNMR 譜)分類(lèi)法、紅外光譜分類(lèi)法、電子自旋共振(ESR)譜分析法等[1]。通過(guò)化學(xué)分析法分析膽結(jié)石中膽固醇含量，將膽固醇含量≥70%的結(jié)石歸為膽固醇型結(jié)石，將膽固醇含量≤30%的結(jié)石歸為膽色素型結(jié)石，介于二者之間的(30%～70%)歸為混合型結(jié)石，此方法現(xiàn)為教科書(shū)中經(jīng)典的膽結(jié)石成分分類(lèi)法[5]。因此，由于膽色素代謝和膽固醇代謝的交織，膽固醇性結(jié)石當(dāng)中往往也有比較多的膽色素，而膽色素性結(jié)石當(dāng)中往往也有比較多的膽固醇出現(xiàn)[8]。

1.2 膽固醇結(jié)石的成因

膽固醇結(jié)石的形成是由復(fù)雜的遺傳基因調(diào)控和機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致的結(jié)果[2,9-10]。研究者猜想膽汁中可能同時(shí)含有促核因子和抗核因子，其含量的不平衡可能導(dǎo)致膽固醇快速結(jié)晶從而形成結(jié)石，但這一說(shuō)法仍需要更多的研究來(lái)證實(shí)[2,12-14]。黏蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)膽固醇結(jié)晶成石的蛋白分子，還有許多其他蛋白也被認(rèn)為是影響膽汁中膽固醇結(jié)晶的促核因子或抗核因子，但它們作用機(jī)制仍不清楚[2,15-17]。2010年，有研究首次提出了膽結(jié)石病的五種致病因素，分別為：①遺傳因素和Lith家族基因；②肝膽固醇的高量分泌，導(dǎo)致膽固醇過(guò)飽和(即高膽固醇飽和指數(shù))；③膽固醇的結(jié)晶與晶體的生長(zhǎng)(相變)；④膽囊運(yùn)動(dòng)受阻；⑤腸道因素(包括膽固醇的吸收以及腸道微生物菌群的變化等)[4]。遺傳基因因素調(diào)控肝膽固醇持續(xù)性的高分泌，導(dǎo)致膽固醇過(guò)飽和，加速膽固醇結(jié)晶，而膽囊運(yùn)動(dòng)功能受損則引起了黏蛋白凝膠的產(chǎn)生并積累，促進(jìn)膽泥的形成和微小結(jié)石的生長(zhǎng)，這些改變破壞了膽汁酸肝腸循環(huán)系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致膽汁酸池發(fā)生了變化，同時(shí)，腸道微生物群的異常也會(huì)影響肝、腸道和膽汁中膽固醇和膽汁酸的代謝，并損害膽囊的排空和再灌注。因此，上述五種因素是通過(guò)交織互作、相互影響來(lái)引起機(jī)體膽固醇結(jié)石的形成[4,18-20](圖1)。

圖1 膽固醇結(jié)石病的五種致病因素及其交織互作示意圖

2 膽固醇結(jié)石小鼠模型的建模研究

2.1 膽固醇結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究

膽固醇結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型可以幫助研究者深入研究該疾病的病理生理學(xué)，有助于開(kāi)發(fā)出創(chuàng)新有效的治療方法。膽固醇結(jié)石模型的造模有幾種方法：如感染法、膽汁淤積法、藥物注射法(林可霉素)、基因編輯、飲食誘導(dǎo)等[2,21-23]。在飲食誘導(dǎo)方面，從20世紀(jì)50年代開(kāi)始，研究者就通過(guò)給倉(cāng)鼠、小鼠、豚鼠、松鼠、土撥鼠、兔子和猴子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)數(shù)周到幾個(gè)月的致石飼料成功建立了膽固醇結(jié)石模型，利用模型研究膽結(jié)石疾病的發(fā)病機(jī)制[2]。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，用于膽結(jié)石模型建立的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，小鼠排在第二位，使用頻率比較高的有豚鼠(40.98%)、小鼠(27.87%)、兔(26.22%)、犬(1.64%)、金黃地鼠(1.64%)和樹(shù)鼩(1.64%)(表1)[24]。

表1 不同膽固醇結(jié)石實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及其使用比例

2.2 膽固醇結(jié)石小鼠模型的建模研究

小鼠是良好的膽固醇結(jié)石造模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[24-25]。給8種近交系小鼠飼喂致石飼料10周后觀察到小鼠出現(xiàn)膽結(jié)石，成石率0%～100%[26]；有研究進(jìn)一步確認(rèn)了小鼠在致石飼料的喂養(yǎng)下，膽結(jié)石患病率存在品系和性別差異[27-28]；有研究發(fā)現(xiàn)基因編輯小鼠在致石飼料的短期喂養(yǎng)下很快就出現(xiàn)了膽固醇結(jié)石[29]。這些研究結(jié)果表明，C57BL/6品系小鼠最適合用于膽結(jié)石造模，在飲食誘導(dǎo)的條件下成石時(shí)間較快，特別是在伴隨一些調(diào)控基因缺失時(shí)，這些研究分析為小鼠膽結(jié)石造模研究打下了良好基礎(chǔ)(表2)。

表2 不同品系、性別、處理的小鼠膽固醇結(jié)石造模

近年來(lái)小鼠膽結(jié)石模型使用頻率大為增加，這是因?yàn)樾∈笤炷７椒ê?jiǎn)單，膽固醇結(jié)石形成速度快，小鼠對(duì)致石飼料敏感，膽汁量、結(jié)石數(shù)量較多且血液和組織標(biāo)本的提取工作相對(duì)其他動(dòng)物容易等。至20世紀(jì)90年代，第一個(gè)與膽結(jié)石相關(guān)的基因Lith1在近交系C57L/J小鼠中得以鑒定，隨后，在小鼠結(jié)石造模研究中發(fā)現(xiàn)了膽結(jié)石易感鼠C57L/J和抗膽石癥鼠AKR/J之間成石的差異是由兩個(gè)Lith基因決定，即Lith1和Lith2[30]。之后研究者通過(guò)更多的近交系小鼠膽結(jié)石模型研究發(fā)現(xiàn)了更多的Lith基因(Lith1～Lith25)參與到膽結(jié)石的成石調(diào)控中來(lái)[31]。這些成果為研究人類(lèi)結(jié)石基因和探索人類(lèi)膽石形成的機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。

3 致石飼料在小鼠模型的應(yīng)用現(xiàn)狀

研究發(fā)現(xiàn)，腸道膽固醇的高效率吸收和高膽固醇飲食方式是小鼠膽固醇結(jié)石的兩個(gè)重要成因[2]。腸道吸收膽固醇后運(yùn)送至肝并分泌于膽汁的這一代謝通路一旦受到影響，膽固醇就容易出現(xiàn)結(jié)晶并導(dǎo)致膽結(jié)石的形成，如膽固醇的過(guò)量攝入和酯化、腸細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受損、乳糜微粒的聚集等因素[4]。膽固醇的過(guò)量攝入是膽結(jié)石的首要前提，因此，通過(guò)飲食來(lái)誘導(dǎo)小鼠膽固醇結(jié)石是常用的造模方法之一。致石飼料的主體部分和常規(guī)飼料基本一致，除了滿(mǎn)足小鼠需要的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之外，更重要的是，致石飼料還需額外考慮設(shè)計(jì)不同的造模因子組合來(lái)誘導(dǎo)小鼠膽固醇結(jié)石的發(fā)生，如高比例膽固醇、油脂、膽酸的使用等。

1964年，有研究者率先發(fā)現(xiàn)了在小鼠飼料中添加膽固醇和膽酸的組合可以有效建立小鼠膽結(jié)石模型。他們給小鼠喂養(yǎng)含有膽固醇和膽酸的致石飼料后，發(fā)現(xiàn)從膽石中提取出來(lái)的甾醇基本上是膽固醇，占了結(jié)石總重量的94%，而單獨(dú)喂養(yǎng)1%膽固醇2～8個(gè)月卻不能誘發(fā)出膽結(jié)石，以此推測(cè)膽酸在小鼠膽結(jié)石模型建立中必不可少，是促進(jìn)膽石形成的重要條件[6]。隨后，研究者在致石飼料中設(shè)計(jì)高脂肪、高膽固醇和一定比例的膽酸誘導(dǎo)小鼠膽固醇結(jié)石的發(fā)生，結(jié)果在誘導(dǎo)8周后小鼠都能不同程度成模[27,32-33]。

因此，根據(jù)上述研究者的經(jīng)驗(yàn)，在目前致石飼料的設(shè)計(jì)和應(yīng)用中，脂肪的用量一般為15%～30%，通常為豬油或者黃油等高飽和脂肪，膽固醇的使用劑量為1%～1.25%，而膽酸的用量則穩(wěn)定在0.5%(表3)。

表3 不同造模因子設(shè)計(jì)對(duì)小鼠膽結(jié)石造模的影響

小鼠膽結(jié)石模型的建立為研究同源人類(lèi)結(jié)石基因和探索人類(lèi)膽石形成機(jī)制以及對(duì)癥治療奠定了良好的研究基礎(chǔ)。膽結(jié)石與很多消化內(nèi)科病或其他疾病有著密切的關(guān)聯(lián)，小鼠膽結(jié)石模型的建立對(duì)研究腸道菌群的變化、高血脂、高胰島素血癥、非酒精性脂肪肝、肥胖、糖尿病、衰老以及不運(yùn)動(dòng)的生活方式帶來(lái)的疾病等方面都有著重要的意義。因此，致石飼料的研制與應(yīng)用，作為膽結(jié)石研究的上游工作，顯得尤為重要。合理的造模因子設(shè)計(jì)，穩(wěn)定安全的飼料原料品質(zhì)，合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系選擇，是膽固醇結(jié)石模型成功建立的最重要因素。