應用24個微衛星標記分析SD和Wistar大鼠的遺傳多樣性*

李 歡 魏 杰 左 琴 王 洪 周佳琪 光姣娜 范 濤 付 瑞 劉佐民 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

實驗動物是現代生物醫學發展的重要基礎，其質量直接影響著相關科研應用的發展水平。按遺傳學控制方法，根據基因純合程度可將實驗動物分為近交系、突變系、雜交群和封閉群四類。Wiatar 大鼠和SD大鼠是我國引進最早、使用最廣泛封閉群大鼠品系，具有較好的基因雜合性，比近交系具備生活力和生育力強、繁殖率高的優點，自引入后就得到了大量生產以及在生物制品和化學藥品的檢定中廣泛應用。

隨著應用需求不斷發展，對封閉群大鼠的遺傳質量控制也提出了更高要求。一方面需要進行科學的飼育管理，同時也需要進行定期遺傳監測反饋與生產應用，從而保障群體相對穩定的基因異質性，避免近交分化。在GB 14923—2010哺乳類實驗動物的遺傳質量控制國家標準實施之前，對于封閉群遺傳質量檢測缺乏明確的要求，這就使得封閉群大鼠的遺傳質量長期處于“失控”狀態，不利于其良性發展。

微衛星DNA標記是由2～6 bp核苷酸單位組成的多次串聯重復序列，又稱短串聯重復序列(short tandem repeats,STRs)或簡單重復序列(simple sequence repeat,SSR)，具有分布廣泛、多態性豐富、穩定性和重復性好的特點。作為群體遺傳的理想分子標記，也被GB 14923—2010作為封閉群遺傳檢測的推薦方法。本研究采用了微衛星標記法，選取了覆蓋大鼠21條染色體的24個微衛星位點對本單位SD和Wistar大鼠封閉群進行遺傳結構分析，從而為SD大鼠和Wistar大鼠封閉群的群體質量控制和應用提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

隨機從本單位選取SPF動物SD和Wistar大鼠各24只，雌雄各半，單雄性鼠體質量在500～600 g,雌性在280～400 g，30周齡。SD大鼠和Wistar大鼠生產許可證號【SCXK(京)2017-0005】。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1儀器：ABI Veriti96 PCR儀(ABI)、Bio-Rad BASIC(Bio-Rad)、GelLogic 212Pro(柯達)、微量分光光度計 Implen NanoPhotometer N50(Implen)。

1.2.2試劑：TAE緩沖液(生工Sangon Biotech)、100 bp DNA marker(TaKaRa)、Taq酶(TaKaRa)、ddH2O、Ex Red核酸染料(北京莊盟)、蛋白酶K(TaKaRa)。

1.3 引物選擇

微衛星位點選自文獻《實驗小鼠、大鼠微衛星 DNA 檢測法標準的編制》[1]，該標準中微衛星位點經過嚴格篩選及優化并經多家單位驗證后具有較好的重復性和可行性，可成為國家標準GB/T 14927.1—2008 的補充。位點信息見表1，由北京擎科新業生物技術有限公司合成并進行熒光染料標記。

表1 本研究采用的24個微衛星位點標記信息

1.4 實驗方法

1.4.1樣本DNA提取：剪取鼠尾組織0.5 cm置于EP管中，經水浴鍋中過夜消化后，利用三氯甲烷/異戊醇抽提法進行DNA的提取，然后通過瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計測量DNA的完整性、純度、濃度。當樣本DNA A260/280在1.8～2.0為合格，并將純度稀釋到40～80 ng/μL，在-20°條件下保存備用。

1.4.2PCR反應體系及擴增條件：總體系為20 μL，ddH2O 13.3 μL，10×PCR緩沖液2 μL，dNTP 1.2 μL，TaqE酶0.5 μL，上、下游引物各1 μL，樣品DNA 1 μL。PCR擴增反應條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個擴增循環，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

1.4.3基因測序：所得PCR擴增結果由北京擎科新業生物技術有限公司進行二代測序。

1.5 數據分析

采用Popgen32軟件處理二代測序數據，分別分析兩群體的等位基因數、有效等位基因數、平均雜合度等遺傳結構參數，使用Little Programe軟件計算微衛星位點的多態性信息含量，并通過網絡在線工具GenePop進行Hardy-Weinberg 平衡及雜合子缺失檢驗。

2 結果

2.1 SD和Wistar群體遺傳多樣性分析

通過Popgen32軟件對二代測序數據處理后得到兩群體遺傳結構參數。SD遺傳結構參數結果見表2，SD群體的平均等位基因數為3，平均雜合度為0.434 4，平均多態信息含量為0.38，D1Rat345、D8Rat14、D10Wox12、AGT呈單態位點。Wistar遺傳結構參數見表3，Wistar群體中的平均雜合度為0.426 1，平均等位基因數為2.95，平均多態信息含量為0.37，D6Mit1、D11 Mgh3、MBPA、PRPS2呈單態。總體來看，SD群體遺傳多樣性比Wistar群體遺傳多樣性豐富。

表2 SD大鼠遺傳結構參數

表3 Wistar大鼠遺傳結構參數

2.2 兩群體的Hardy-Weinberg平衡檢驗

利用在線網絡Genepop通過Markov chain(MC)精確檢驗方法對兩只大鼠群體進行Hardy-Weinberg平衡檢測，并進行雜合子缺失檢驗。結果見表4，在SD群體中D1Mgh14、D3Wox9、D5Hmgc2、D7Mgh3、D9Mit2、LCA、D15Mit3、MBPA、TNF、PRPS2 共計10個微衛星位點偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，其中D1Mgh14、D7Mgh3、D9Mit2、LCA、MBPA、TNF、PRPS2位點表現為雜合子缺失(Fis>0)；Wistar群體中D3Wox9、D7Mgh3、D10Wox12、D11Wox3、D12Mit2、LCA、D15Mit3、TILP、TNF共計9個微衛星位點偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，其中D7Mgh3、LCA、TNF、D12Mit2位點表現為雜合子缺失(Fis>0)。

表4 SD和Wistar的Hardy-Weinberg 平衡及雜合子缺失檢測

3 討論

3.1 標記位點的多態性分析

據報道，在國際上一些實驗動物生產機構，如Jackson Lab、Charles River、Taconic、Harlan雖提出遺傳檢測標準，如Charles River 采用6～9個STR位點進行近交系檢測，Taconic采用2個STR區分有差別的近交系，但是他們在進行小鼠、大鼠遺傳質量微衛星檢測時采用的位點及數量并不相同[2]。我國發行的T/CALAS 21-2017團體標準中明確規定了對實驗動物大、小鼠進行微衛星檢測時選取微衛星位點要盡量覆蓋小鼠的20條染色體和大鼠的21條染色體[3]。本文所選取的24個微衛星位點覆蓋了大鼠的21條染色體，相比傳統生化標記檢測，該檢測覆蓋了封閉群大鼠全部染色體，從而可以較為全面客觀體現大鼠的遺傳概貌。

多態信息含量(PIC)可以用來評定一個遺傳標記在群體檢測多態性時的價值。PIC值大小取決于標記位點的等位基因數目及其頻率分布。有研究指出PIC>0.5的標記位點為高度多態座位，即可以提供較高的遺傳信息；0.25

3.2 SD和Wistar大鼠群體遺傳多樣性分析

從分子水平看遺傳多樣性指的是某一品系或品種內個體間DNA水平的差異，遺傳多樣性降低，有價值的基因可能丟失，進而品種的質量和育種的潛能下降[8]。因此對實驗動物的遺傳多樣性進行分析，有助于掌握實驗動物的遺傳背景，從而對其質量進行檢測及控制。本研究應用24個微衛星標記在SD大鼠群體中檢測到平均等位基因數為3個，最多位點的等位基因有6個，最低的有1個。Wistar群體中平均每個基因座位有2.958個等位基因，最多位點的等位基因有7個，最低的有1個。有效等位基因數是指在理想的群體中，一個基因座位產生與實際群體中相同純合度所需要的等位基因數[9]。有效等位基因數與實際所檢測到的等位基因數越接近，表明在群體中的等位基因分布越均勻。本研究中SD和Wistar群體的平均有效等位基因數分別為2.118 4、2.163 4個，實際檢測到平均等位基因數分別為3、2.958 3個。平均有效等位基因數與實際檢測到的基因數有一定差距，表明所選取的24個微衛星位點的等位基因在SD和Wistar群體分布不均勻。

雜合度是反映群體多個基因座位遺傳變異程度的指數，即雜合度越高，遺傳變異程度越大，群體遺傳多樣性也越高。本研究得到SD和Wistar兩群體的平均雜合度分別為0.434 4、0.426 1。有研究選取6個多態性較好的微衛星位點對Wistar和SD遺傳背景進行分析[10]，最后得到SD群體和Wistar群體平均雜合度分別為0.585 9、0.598 2，要高于本研究所得到的平均雜合度參數。其原因可能是：第一，實驗選取的微衛星數量及種類不一樣；第二，所選種群非同一群體，且封閉群封閉管理，保種時間長，在后代繁殖過程中發生了遺傳漂變。而發生遺傳漂變程度與群體大小密切相關，群體越小，漂變速度越快[11]。本實驗所檢測實驗動物來自40對基礎群體，雖然采用循環交配方式進行繁育，但其有效群體含量相對較小，故受到的遺傳漂變影響較大。因此后期要加強對基礎種群的建設，定期對實驗動物進行遺傳質量檢測。

3.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡及雜合子缺失檢驗

目前，常用的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗方法主要有卡方檢驗、精確檢驗。對于STR遺傳標記，由于檢測樣本含量相對較少而等位基因相對過多，使得眾多的低頻率基因型無法被觀察到，為此使用Hardy-Weinberg平衡精確檢驗更為合適[12]。固定指數Fis又稱近交系數，用來衡量群體雜合子頻率與Hardy-Weinberg平衡群體預期的雜合子頻率的差異。當Fis>0為雜合子缺失，表明群體有近交分化；Fis<0為雜合子過量，表明群體避免了近交分化或者存在雜合子優勢[13]。在GenePop中對于Fis估算主要有Weir&Cockerham(1984)即W&C和Robertson&Hill(1984)即R&H兩種[14]。通過Hardy-Weinberg平衡及雜合子缺失檢測，SD群體中有10個位點偏離平衡(P<0.05)，其中有7個位點表現為雜合子缺失。Wistar群體中有9個位點偏離平衡(P<0.05)，其中有5個位點表現為雜合子缺失。兩個群體中偏離Hardy-Weinberg平衡的位點均含有中高度多態性信息含量，總體來看，SD群體的遺傳多樣性要比Wistar遺傳多樣性高。封閉群實驗動物繁育過程會受到人工因素影響，因此某些位點偏離Hardy-Weinberg平衡也較為常見[15]。對于偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡的位點，很有可能是實驗動物在封閉繁育的時候并未實現隨機交配而導致群體產生近交現象。因此后期在進行封閉群繁育管理中，要定期進行遺傳監測。只有通過定期的遺傳檢測，才可以發現實驗動物群體所存在的問題，進而根據結果采取相應的對策。