比格犬關(guān)節(jié)滑液代謝組學(xué)研究*

劉清平 黃永平 陳 蕓 萬 娟 田 松 賀爭鳴 胡曼麗 丁 一 白 蘭 張 鑫

(1.贛南創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院；心腦血管疾病防治教育部重點實驗室；贛南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，贛南醫(yī)學(xué)院，贛州 341000)(2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430072)(3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)(4.武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060)(5.中國食品藥品檢定研究所，北京 100050)(6.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

隨著經(jīng)濟發(fā)展和消費業(yè)態(tài)的改變，我國養(yǎng)寵理念在過去十余年發(fā)生明顯改變，寵物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧胰恕閭H的角色。目前全國寵物數(shù)量超過1億只，其中有約50%的寵物正承受著關(guān)節(jié)疾病的困擾[1]。以寵物犬為例，先天關(guān)節(jié)發(fā)育不良和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多見于幼犬，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎常見于成年犬，犬關(guān)節(jié)炎則多發(fā)于老年犬[2]。寵物關(guān)節(jié)保健至關(guān)重要，及早對寵物進行關(guān)節(jié)養(yǎng)護能有效減輕寵物不同時期關(guān)節(jié)損傷和疼痛。犬關(guān)節(jié)炎臨床治療主要采取抗炎和鎮(zhèn)痛措施，而批準(zhǔn)上市的寵物專用抗炎鎮(zhèn)痛藥稀少，常用藥物美洛昔康在有效治療犬關(guān)節(jié)炎的同時卻引起胃腸道不良反應(yīng)，不適合作為長期養(yǎng)護關(guān)節(jié)的策略。此外，由于缺乏對寵物關(guān)節(jié)疾病機制的深入研究和理解，目前市面上關(guān)于寵物的關(guān)節(jié)營養(yǎng)產(chǎn)品，大多只停留在補鈣或單種成分補充的初級階段，導(dǎo)致眾多寵物的關(guān)節(jié)問題無法有效解決。因此，充分認識犬關(guān)節(jié)發(fā)育的代謝特征，有針對性地補充不同時期關(guān)節(jié)所需營養(yǎng)，才能有效地保證寵物關(guān)節(jié)和骨骼的健康。

代謝組學(xué)關(guān)注內(nèi)源性代謝物(相對分子質(zhì)量小于1 500)在生命體系受外界刺激(如疾病侵襲、藥物干預(yù)、環(huán)境變化等)、病理生理變化以及本身基因突變所產(chǎn)生的應(yīng)答變化規(guī)律[3-4]。目前廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥靶篩選、個性化藥物治療、作用機制研究和基因功能闡明，為疾病過程認識和藥物理論體系的研究提供了整體的思路和系統(tǒng)的方法[4-5]。非靶向代謝組學(xué)使用高分辨質(zhì)譜儀，對樣本中的代謝物進行無偏向、大規(guī)模、系統(tǒng)性檢測，最大程度反映生物體內(nèi)代謝水平擾動情況[6]。液相色譜法與質(zhì)譜法(LC-MS)相結(jié)合，在分析復(fù)雜生物流體(如關(guān)節(jié)腔滑液)方面顯示出巨大優(yōu)勢[7]。

本研究使用超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(UHPLC-Q-TOF MS)進行犬關(guān)節(jié)腔滑液代謝組學(xué)檢測和分析，選取幼年和成年比格犬的關(guān)節(jié)滑液，研究這兩個年齡段的關(guān)節(jié)腔滑液的代謝特征，尋找其在犬不同年齡段的代謝差異，從而發(fā)現(xiàn)比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育與關(guān)節(jié)滑液代謝成分變化的關(guān)系。本研究基于LC-MS的代謝組學(xué)譜作為量化關(guān)節(jié)腔滑液內(nèi)代謝物的工具，發(fā)現(xiàn)犬在不同發(fā)育階段的關(guān)節(jié)代謝標(biāo)志物，用于探索犬關(guān)節(jié)發(fā)育的特征和關(guān)節(jié)養(yǎng)護的策略研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗選取體格正常的18只幼年(<12個月；雌、雄各9只)比格犬和16只成年(≥12個月且≤65個月；雌、雄各8只)比格犬，在受控的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境【12 h∶12 h晝夜間斷照明，溫度(23.5±1)℃，相對濕度(60±10)%】中適應(yīng)性飼養(yǎng)。犬基礎(chǔ)飼料購買自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進行基礎(chǔ)體檢，評估比格犬骨關(guān)節(jié)和生理健康水平。所有動物實驗經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審查，倫理審批號：2021334，符合美國國家科學(xué)院和美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布的《實驗動物護理和使用指南》。

1.2 設(shè)備及試劑

AB Triple TOF 6600質(zhì)譜儀(AB SCIEX)、Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent)、低溫高速離心機(Eppendorf 5430R)、色譜柱(Waters, ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm column)、DigiEye 380 DR X線攝影裝置(深圳邁瑞)、乙腈(Merck,1499230-935)、乙酸銨(Sigma,70221)、甲醇(Fisher, A456-4)、氨水(Fisher, A470-500)、硫酸阿托品(吉林華牧)、舒泰50(法國維克)。

1.3 血常規(guī)分析

動物完成基礎(chǔ)體檢后，將采血針插入頭遠端靜脈采集少量靜脈血。將全血標(biāo)本送往惠康動物檢測(武漢)有限公司醫(yī)學(xué)檢驗實驗室進行常規(guī)血液檢查。

1.4 骨關(guān)節(jié)X線分析

為防止實驗犬麻醉后食道中食靡和水反流導(dǎo)致窒息死亡，X線檢查前對實驗犬進行常規(guī)禁食禁水(禁食12 h，禁水4 h)。麻醉采用0.04 mg/kg皮下注射硫酸阿托品，15 min后按5 mg/kg靜脈推注舒泰50，待實驗犬意識消失，全身肌肉松弛后拍攝X線片。將犬置于診斷床上“仰臥保定”，進行腹背位拍片，X線片暗盒放在兩髖關(guān)節(jié)與診斷床之間，薦椎與腰椎緊貼暗盒的中心線。一助手握住犬的兩前腳向前拉使兩個腕關(guān)節(jié)與診斷床的中心線成等距離平行，另一助手緊握兩個膝關(guān)節(jié)向后拉使兩股骨與診斷床的中心線或等距離平行。根據(jù)犬體型選擇投照條件，本實驗中投照條件為70 kV，2.5 mAs，F(xiàn)FD=56 cm。

1.5 關(guān)節(jié)滑液采集

使用1 mL注射器從比格犬左后肢膝關(guān)節(jié)抽取關(guān)節(jié)滑液樣本0.1 mL，避免血液及毛發(fā)等污染。將關(guān)節(jié)滑液收集到EP管中，通過在室溫環(huán)境下4 000 r/min離心20 min，從滑液中除去細胞，然后在液氮中快速冷凍至少15 min，并在-80 ℃下儲存。

1.6 非靶向代謝組學(xué)

在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍關(guān)節(jié)滑液樣品，將100 μL樣品與400 μL預(yù)冷的甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1, v/v)渦旋混勻，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，然后離心20 min(12 000 r/min，4 ℃)，取上清真空干燥。將干燥的樣品重新溶解在100 μL乙腈水溶液(1∶1，v/v)中并渦旋混合，然后離心15 min(12 000 r/min，4℃)，收集上清液送往上海中科新生命生物科技有限公司進行非靶向代謝組學(xué)分析。

關(guān)節(jié)滑液樣品的代謝物在Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)HILIC色譜柱進行分離。柱溫25 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量2 μL。流動相組成A含有25 mmol乙酸銨和25 mmol氨水，流動相組成B含乙腈。根據(jù)以下梯度程序?qū)崿F(xiàn)色譜分離：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，65% B；7～8 min，40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，95% B；和 9.1～12 min，95% B。整個過程中將樣品置于4 ℃的自動進樣器中。以隨機順序進行連續(xù)樣品分析，并在隊列中插入質(zhì)控樣品以監(jiān)測和評估系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

樣品經(jīng)色譜分離后，用Triple TOF 6600質(zhì)譜儀(AB SCIEX)進行質(zhì)譜分析，采用電噴霧電離(離子源溫度：600 ℃)進行正負離子模式檢測(離子噴霧電壓：±5 500 V，正負兩種模式)。MS-only 采集模式的m/z范圍設(shè)置為60至1 000 u，其掃描累積時間為0.20 s/譜。自動MS/MS采集模式下的m/z范圍設(shè)置為25至1 000 u，累積時間為0.05 s/譜。離子掃描采用數(shù)據(jù)依賴型采集，選擇峰強度值篩選模式。去簇電位為±60 V(正負兩種模式)，碰撞能量為(35±15)eV。動態(tài)排除4 u以內(nèi)的同位素離子，每次掃描采集10個碎片圖譜。

將Wiff格式的原始數(shù)據(jù)通過ProteoWizard轉(zhuǎn)換成mzXML文件，然后導(dǎo)入XCMS軟件獲取可用數(shù)據(jù)，然后進行峰對齊、保留時間校正、提取峰面積。對XCMS提取得到的數(shù)據(jù)首先進行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理，然后進行實驗數(shù)據(jù)質(zhì)量評價，最后進行數(shù)據(jù)分析。

1.7 多元數(shù)據(jù)分析

對數(shù)據(jù)進行歸一化(Normalization)、立方根數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(Cube root transformation)、Pareto標(biāo)尺化(Scaling)等處理，以減少變量方差異性，增加數(shù)據(jù)間的可比性。使用ropls R包、構(gòu)建有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)模型，鑒別模型中對于區(qū)分各組間代謝譜差異貢獻較大的代謝物。并計算了OPLS-DA模型中投影的變量重要性(VIP)。每個變量的VIP值表示特定代謝物對分類的貢獻。采用VIP值>1和相應(yīng)的P值<0.05篩選變化顯著的代謝物。

1.8 差異代謝物分析

使用HMDB 5.0版(https://hmdb.ca/)對所得代謝物進行校對，以確定它們的來源是內(nèi)源性還是外源性。然后，運用KEGG數(shù)據(jù)庫注釋代謝產(chǎn)物。在KEGG通路富集分析中，評估屬于某個通路的代謝物出現(xiàn)的頻率是否比隨機預(yù)期的更頻繁，以確定受到顯著影響的代謝和信號傳導(dǎo)通路。使用z score方法通過公式y(tǒng) =(真實值-所有樣品的平均值)/所有樣品的方差來歸一化各種代謝物的水平。采用差異豐度(Differential abundance, DA)評分來捕捉途徑中所有代謝物的總體趨勢。在本研究中應(yīng)用 Benjamini-Hochberg 校正的 Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗來計算某個途徑中所有代謝物的差異豐度得分。代謝物豐度的增加/減少定義為陽性/陰性DA評分。具體來說，得分為1表示該途徑中所有代謝物的豐度增加，而DA得分為-1表示所有代謝物的豐度降低。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實驗流程示意圖

實驗選取體格正常的比格犬，首先對其左后肢膝關(guān)節(jié)進行X線影像檢查，然后從左后肢膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)抽取關(guān)節(jié)滑液標(biāo)本100 μL，進行非靶向代謝組學(xué)檢測。分析比格犬關(guān)節(jié)滑液的整體代謝圖譜，雌、雄性比格犬各自在幼年與成年時期的代謝差異，以及雌性與雄性比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過程中關(guān)節(jié)滑液的代謝異同(圖1)。

圖1 實驗流程圖

2.2 比格犬血常規(guī)和膝關(guān)節(jié)X線影像分析

表1血常規(guī)分析顯示，幼年犬血液中大部分免疫相關(guān)細胞、紅細胞和血小板的含量正常，白細胞和中性粒細胞含量略超出臨床參考值范圍，說明部分幼年犬存在感染和輕度炎癥，可能是由于幼年犬免疫力較低所致。圖2犬X線影像顯示，幼年犬和成年犬的膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)均屬正常，無顯著性膝關(guān)節(jié)病變，包括關(guān)節(jié)骨對位不良、韌帶損傷、骨關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、腫瘤等，可排除關(guān)節(jié)病變導(dǎo)致的關(guān)節(jié)滑液代謝異常。

圖2 比格犬左后肢膝關(guān)節(jié)X線影像分析

表1 比格犬血常規(guī)指標(biāo)及參考范圍

2.3 比格犬關(guān)節(jié)滑液的整體代謝圖譜

采集上述健康比格犬關(guān)節(jié)滑液進行非靶向代謝組學(xué)檢測，利用差異代謝物精確m/z值在HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、LIPID MAPS(http：//www.Lipidmaps.Org/)等數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合差異代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息(加合離子、準(zhǔn)確質(zhì)荷比、保留時間、MSE二級信息)，尋找信息匹配的可能代謝物。本項目最終共鑒定出1 604種代謝物，其中正離子模式鑒定出1 055種代謝物，負離子模式鑒定出549種代謝物。圖3A所示為幼年雌、雄犬和成年雌、雄犬顯著性差異代謝物的層次聚類熱圖，圖中每行代表一個差異代謝物(即縱向為顯著性差異表達的代謝物)，每列代表一組樣品(即橫向為樣品信息)，黃色代表顯著性上調(diào)，藍色代表顯著性下調(diào)，顏色深淺表示上、下調(diào)的程度。

根據(jù)化學(xué)分類歸屬信息，將本項目鑒定到的所有代謝物(合并正、負離子鑒定到的代謝物)分為8類進行統(tǒng)計，各類代謝物數(shù)量及所占比例如圖3B，C所示。脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、有機酸及其衍生物類別的代謝物數(shù)量最多，約占關(guān)節(jié)滑液總代謝物含量的50%，其中脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子含量占比30.2%，有機酸及其衍生物含量占比19.9%。另外，還鑒定到關(guān)節(jié)滑液中含有10.1%有機雜環(huán)化合物、9.6%苯環(huán)烴類、6.9%有機氧化合物、4.3%苯丙烷和聚酮類、2.7%有機氮化合物、2.7%核苷及核苷類似物和13.5%其他化合物。每類代謝產(chǎn)物在幼年雌、雄犬和成年雌、雄犬關(guān)節(jié)滑液樣品中的檢出豐度如圖3D所示。

2.4 雄性比格犬幼年與成年時期關(guān)節(jié)的代謝差異

單獨比較雄性幼年犬和成年犬的關(guān)節(jié)滑液的代謝組學(xué)特征(圖4)。在正、負離子模式下，分別建立OPLS-DA模型，從圖4A中可以發(fā)現(xiàn)兩組樣品分別緊密聚集到一起，并得到了明顯分離，說明兩組樣本中的內(nèi)源性代謝物圖譜存在顯著性差異(圖4A)。為了避免有監(jiān)督模型在建模過程中發(fā)生過擬合，我們采用置換檢驗(Permutation test)進行檢驗，以保證模型的有效性。置換檢驗使用交叉驗證的兩個參數(shù)R2和Q2進行評價(R2表示模型的方差大小和擬合的優(yōu)良度，Q2表示模型預(yù)測值的方差大小和預(yù)測能力)。正離子模式下OPLS-DA置換檢驗顯示R2Y等于0.898，Q2等于0.676；負離子模式下顯示R2Y為0.97，Q2為0.625，說明模型不存在過擬合現(xiàn)象，具有良好的穩(wěn)健性和預(yù)測能力(圖4B)。

雄性犬關(guān)節(jié)滑液代謝組學(xué)共鑒定出386種代謝物在幼年犬與成年犬中顯著不同(VIP>1,P<0.05)。與幼年犬相比，成年犬關(guān)節(jié)滑液中有93個代謝物的含量顯著增加，293個代謝物含量顯著減少(圖4C)。含量水平升高的內(nèi)源性代謝物中，(+)-3-(3,4-亞甲二氧基苯基)-1,2-丙二醇的VIP值最大，其次是異丁酰甘氨酸、高瓜氨酸、白三烯 C4、3-甲氧基-4-羥基苯基乙二醇硫酸鹽和假尿苷等。濃度降低的內(nèi)源性代謝物中，L-哌可酸的VIP值最大，其次是脯氨酸甜菜堿、N(6)-甲基賴氨酸、7-甲基鳥苷和1-甲基組胺(圖4D)。通路富集分析表明，差異代謝物主要參與組氨酸代謝、精氨酸生物合成、嘧啶代謝、ABC轉(zhuǎn)運體、D-氨基酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、GABA突觸信號通路等生理過程(圖4E)。

注：A.OPLS-DA模型得分圖;B.OPLS-DA模型置換檢驗圖；圖中橫坐標(biāo)表示置換保留度，即與原模型 Y 變量順序一致的比例，縱坐標(biāo)表示R2和Q2的值。綠色的點表示R2，藍色的點表示Q2;C.正負離子模式火山圖;D.顯著性差異代謝物表達差異柱狀圖;E.KEGG通路富集分析圖

2.5 雌性比格犬幼年與成年時期關(guān)節(jié)的代謝差異

雌性幼年犬和成年犬的關(guān)節(jié)滑液的代謝組學(xué)特征見圖5。正、負離子模式下，OPLS-DA模型判別顯示幼年組和成年組樣本具有高質(zhì)量的區(qū)分度，說明內(nèi)源性代謝物圖譜差異明顯(圖5A)。模型置換檢驗顯示正離子模式下R2Y等于0.977，Q2等于0.535；負離子模式下R2Y為0.927，Q2為0.593，說明模型擬合度與穩(wěn)健性均良好(圖5B)。

雌性犬關(guān)節(jié)滑液代謝組學(xué)共鑒定到269種代謝物在幼年犬與成年犬中顯著不同(VIP>1,P<0.05)。與幼年犬相比，成年犬關(guān)節(jié)滑液中有143個代謝物的含量顯著增加，126個代謝物含量顯著減少(圖5C)。含量水平升高的內(nèi)源性代謝物中，5-磷酸吡哆醛的VIP值最大，其次是戊二酰肉堿、N-乙酰絲氨酸、假尿苷、谷氨酰胺和1-水楊酸葡糖苷酸等。濃度降低的內(nèi)源性代謝物中，1-甲基腺苷的VIP值最大，其次是7-甲基鳥苷、穗花雙黃酮、脯氨酸甜菜堿和7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)(圖5D)。通路富集分析表明，差異代謝物主要參與嘧啶代謝、ABC轉(zhuǎn)運體、D-氨基酸代謝、礦物質(zhì)吸收、組氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、碳水化合物分解和吸收、蛋白分解和吸收、氨基酰tRAN生物合成的生理過程(圖5E)。

2.6 雌性與雄性比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過程中關(guān)節(jié)滑液的代謝特征

將雌、雄性比格犬關(guān)節(jié)滑液中鑒定到的代謝產(chǎn)物進行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，從幼年到成年過程中，在雌性和雄性中共同上調(diào)的代謝物有18種，包括順式-烏頭酸、α-酮戊二酸、乳清酸核苷-5-單磷酸、胸腺嘧啶等，雄性特異性上調(diào)的代謝物有24種，雌性特異性上調(diào)的代謝物有34種(圖6A，B)。雌性和雄性中共同下調(diào)的代謝物有30種，包括1-甲基-L-組氨酸、2′-脫氧胞苷、胞嘧啶-5-三磷酸、D-麥芽糖等，雄性特異性下調(diào)的代謝物有73種，雌性特異性上調(diào)的代謝物有11種(圖6C，D)。綜上可以看出，從幼年到成年的發(fā)育過程中，雌性比格犬和雄性比格犬關(guān)節(jié)代謝的共同產(chǎn)物有48種，提示這些產(chǎn)物可能是關(guān)節(jié)發(fā)育的潛在標(biāo)志物，精準(zhǔn)的標(biāo)志物確定有待進一步驗證。

注：A、C.雌、雄性比格犬代謝物聯(lián)合分析韋恩圖；B.雌、雄性共同上調(diào)代謝物熱圖；D.雌、雄性共同下調(diào)代謝物熱圖

3 討論

機體的基礎(chǔ)代謝會隨著生物體發(fā)育產(chǎn)生相應(yīng)改變，從而引起小分子代謝物的種類、濃度、比例等發(fā)生變化，最終造成個體間代謝圖譜的差異[8]。代謝組學(xué)通過分析生物樣本中可以反映機體狀況的小分子內(nèi)源性代謝物，對發(fā)育進程進行整體評價[8]。本研究采用UHPLC-Q-TOF MS檢測手段對比格犬關(guān)節(jié)滑液進行測定，以代謝組學(xué)為分析途徑，研究犬關(guān)節(jié)發(fā)育過程中的代謝特征。結(jié)果表明，雄性比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過程中，組氨酸代謝、精氨酸合成、ABC轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)分解和吸收、礦物質(zhì)吸收等過程產(chǎn)生的代謝物減少；雌性比格犬中參與ABC轉(zhuǎn)運、組氨酸代謝、碳水化合物分解和吸收過程的代謝物減少，說明幼年比格犬骨關(guān)節(jié)代謝氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及碳水化合物的能力旺盛。此外，我們還發(fā)現(xiàn)比格犬關(guān)節(jié)發(fā)育過程中有48種代謝物含量發(fā)生顯著性改變，可能是犬關(guān)節(jié)發(fā)育的生物標(biāo)志物。

骨骼由骨基質(zhì)和骨礦質(zhì)組成，骨基質(zhì)主要由氨基酸構(gòu)成，其對骨骼的形態(tài)、大小和柔韌度起到?jīng)Q定性作用；骨礦質(zhì)主要由鈣構(gòu)成，影響骨骼的致密度和堅硬度[9]。氨基酸是各種礦物質(zhì)和微量元素的“搬運工”，鈣、鐵、鋅、硒等各種礦物質(zhì)和微量元素需要氨基酸和蛋白質(zhì)將它們搬送到機體各處[10]。氨基酸除了具有促進骨骼發(fā)育的作用，還有保護骨骼的功能。例如，精氨酸代謝生成的NO能緩解炎性反應(yīng)與風(fēng)濕癥，對肌腱、關(guān)節(jié)的炎癥和疼痛具有消炎、緩解以及修復(fù)受損細胞與組織的功效[11]；組氨酸代謝能夠有效防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]。

骨骼中70%～80%的有機物屬于膠原蛋白，膠原蛋白有助于骨骼及軟骨的生長，保持骨骼和肌肉的彈性[13]。補充膠原蛋白可以促進關(guān)節(jié)潤滑、防震、減少關(guān)節(jié)軟骨磨損，從而延緩關(guān)節(jié)退行性改變，減輕臨床不適癥狀等[14]。

碳水化合物是機體主要的供能物質(zhì)，不可缺少。優(yōu)質(zhì)的碳水化合物對機體有保護和促進作用，如體質(zhì)量控制、代謝健康、消化道健康等[15]。但也有研究認為飲食中的碳水化合物會引起骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病[16]。然而，并不是不攝入碳水化合物才是健康的模式，而是提倡攝入平衡的碳水化合物，可以通過飲食中碳水化合物、膳食纖維、糖的比例，來判斷飼糧是否含有健康的碳水化合物[17]。

綜上，通過對犬關(guān)節(jié)滑液的代謝組學(xué)研究，系統(tǒng)揭示了犬關(guān)節(jié)代謝的特征，以便針對性地對幼年犬和成年犬的飼糧營養(yǎng)配比進行優(yōu)化，有助于幼年犬關(guān)節(jié)正常發(fā)育和成年犬的關(guān)節(jié)養(yǎng)護。