猴頭菇醇提物及其不同極性部位酚類物質(zhì)定量分析

姚芬，高虹，殷朝敏，史德芳，胡龍，范秀芝

（湖北省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064）

猴頭菇（Hericium erinaceus）屬擔子菌門、擔子菌綱、猴菌目、猴菌科、猴菌屬，是一種珍貴的藥食同源真菌[1]。相關(guān)研究表明猴頭菇具有維護胃腸道健康[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、抗癌[4-5]、抗氧化[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、神經(jīng)保護[9-10]等多種生理功能。然而，目前對猴頭菇功效成分的研究主要集中在多糖、蛋白質(zhì)、多肽、漆酶和甾醇等方面，對酚類物質(zhì)的研究報道相對較少。

植物多酚（polyphenols）是一種具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物，大量研究表明食用菌酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒以及預(yù)防心血管疾病等作用，這些作用均與酚類物質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu)有關(guān)[11-12]。Kawagishi等[13-15]從猴頭菇內(nèi)分離得到Hericenone A，Hericenone B，Hericenone C，Hericenone D，Hericenone E，Hericenone F，Hericenone G和Hericenone H 8種酚類物質(zhì)，其中Hericenone A-C具有抑制宮頸癌細胞的作用；Ma等[16]從猴頭菇子實體中分離得到Hericenone I和Hericene D，并證明這兩種酚類物質(zhì)對食道癌細胞EC109具有細胞毒性作用；胡瀟文[17]從猴頭菇菌絲體中分離得到Hericenone I和Hericene D，并證明這兩種酚類物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)作用。目前，除了結(jié)構(gòu)和功能明確的酚類物質(zhì)Hericenone A-I外，猴頭菇中其它大部分酚類物質(zhì)的研究主要集中在總酚和總黃酮的含量與活性分析上，而對酚類物質(zhì)的組分研究報道較少[18]。本試驗在對猴頭菇有機相提取物進行定性的基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜－電噴霧質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-electro spray ionization-mass spectrometry，UPLC-ESI-MS）對猴頭菇醇提物及其石油醚萃取相、氯仿萃取相、乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相中的14種酚酸和12種黃酮進行定量分析，旨在為研究猴頭菇酚類物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系和今后開展體內(nèi)活性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇：中國林業(yè)栽培采集中心采集的猴頭菌H99菌株（CFCC 83090）在 4℃的 PDA（potato dextros agar）培養(yǎng)基上保存，并在25℃下進行菌種活化，活化后的菌種接種于以60%桑枝、20%葛根渣、18.8%麥麩、1.0%硫酸鈣、0.2%碳酸鈣為基質(zhì)制作的無菌接種袋中[19]。接種袋在溫度23℃～25℃、相對濕度90%的條件下進行培養(yǎng)，待子實體成熟即可采收。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜純）、酚酸標準品、黃酮標準品（均為色譜純）：美國Sigma公司；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-1000VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Q Exactive超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[配有電噴霧離子源（ESI）和Xcalibur工作站]：美國Thermo公司；Acquity超高效液相色譜：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取物的制備

摘取新鮮的猴頭菇子實體，切成小塊于55℃的恒溫干燥箱內(nèi)干燥，恒重后粉碎過80目篩，即得猴頭菇菌粉。將猴頭菇菌粉（600 g）用10倍體積95%乙醇浸提2次，每次24 h。過濾分離殘渣，合并兩次濾液，減壓濃縮，取1/5浸膏凍干得到醇提物（ethanol extraction，EE）。將剩余醇提物按 1∶20（g/mL）溶于蒸餾水中，依次用等體積石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇于600 W超聲功率下萃取1 h，每種溶劑重復(fù)萃取3次，合并提取液，減壓濃縮得到石油醚萃取物（petroleum ether fraction，PEF）18.02 g、氯仿萃取物（chloroform fraction，CF）2.08 g、乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate fraction，EAF）2.07 g、正丁醇萃取物（n-butanol fraction，NF）11.00 g。

1.3.2 樣品前處理

酚酸類化合物樣品制備：精確稱量0.1 g～0.5 g樣品于15 mL玻璃試管中，加入2 mL 1 mol/L NaOH，28℃搖床抽提2 h，加入500 μL 5 mol/L鹽酸，隨后加2 mL乙酸乙酯，離心后吸取乙酸乙酯相，重復(fù)3次。將乙酸乙酯收集到一起，氮氣吹干。加0.5 mL甲醇溶解上機。

黃酮類化合物樣品制備：精確稱量50 mg樣品于2 mL離心管中，加入1 mL甲醇；放水浴鍋中65℃抽提4 h，12 000 r/min離心10 min后取上清液，等待上機。

1.3.3 標準溶液的制備

酚酸混合標準曲線的制備：取900 μL的水溶液于10 mL容量瓶中，依次加入原兒茶酸、沒食子酸、苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、香草醛、丁香醛、4-羥基苯甲酸、芥子酸、反式阿魏酸、氫化肉桂酸和反式肉桂酸標準品各10 mg，加水定容至10 mL，再用甲醇稀釋10倍后即得濃度為100 μg/mL的標樣儲備液。再將儲備液梯度稀釋成 1/100、5/100、10/100、20/100、40/100、60/100、80/100、100/100 ng/mL 工作液備用。

黃酮混合標準曲線的制備：取900 μL 50%的甲醇溶液加入10mL容量瓶中，依次加入L-苯丙氨酸、兒茶素、表兒茶素、牡荊素、槲皮苷、楊梅素、木犀草素、槲皮素、芹菜素、柚皮素、山奈酚和異鼠李素標準品各10 mg，加50%的甲醇溶液定容至10 mL，再用50%甲醇水溶液稀釋10倍后即得濃度為100 μg/mL的標準品儲備液。再將儲備液梯度稀釋成1/1 000、5/1 000、10/1 000、20/1 000、40/1 000、80/1 000、160/1 000、320/1 000、500/1 000 ng/mL工作液備用。

1.3.4 超高效液相色譜條件

Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）液相色譜柱；流動相A（0.1%乙酸-水溶液），流動相B（0.1%乙酸-乙腈）；梯度洗脫：10%A-90%B（0～2 min），60%A-40%B（2 min～9 min），10%A-90%B（9 min～10 min）；進樣量為2 μL；柱溫為40℃；檢測波長280 nm。

1.3.5 質(zhì)譜條件

采用美國Thermo公司的Q exactive高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，電噴霧離子源，分析物在負離子同時掃描下以單離子檢測模式進行分析；鞘氣40 arb；輔助氣10 arb；離子噴霧電壓+3 000 V；溫度350℃；離子傳輸管溫度320℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Peakview 1.2和Analyst 1.6（ABSciex）統(tǒng)計分析，取平均值。采用 SPSS 21.0軟件在P＜0.01水平進行ANOVA單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)標準品色譜圖及標準曲線信息

26種酚類物質(zhì)標準品總離子流圖見圖1。沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、對香豆酸、香草醛、4-羥基苯甲酸、丁香醛、芥子酸、反式阿魏酸、苯甲酸、氫化肉桂酸和反式肉桂酸，14種酚酸類物質(zhì)標準品離子流圖見圖2。26種酚類物質(zhì)標準品繪制標準品線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)如表1所示。L-苯丙氨酸、兒茶素、表兒茶素、牡荊素、槲皮苷、楊梅素、木犀草素、槲皮素、芹菜素、柚皮素、山奈酚、異鼠李素，12種黃酮類物質(zhì)標準品離子流圖見圖3。

表1 酚酸標準品的回歸方程Table 1 Regression equation of standard phenolic acid samples

圖1 酚類物質(zhì)標準品總離子流圖Fig.1 Total current ion diagram of phenolic components standards

圖2 酚酸類物質(zhì)標準品離子流圖Fig.2 Ion current diagram of phenolic acid standards

續(xù)表1 酚酸標準品的回歸方程Continue table 1 Regression equation of standard phenolic acid samples

圖3 黃酮類物質(zhì)標準品離子流圖Fig.3 Ion current diagram of flavonoids standards

從表1中可以看出，所用檢測方法獲得的標準品回歸方程R2均大于0.99，可以用于以上酚酸和黃酮類物質(zhì)的定量分析。

2.2 猴頭菇醇提物及不同有機萃取物中酚酸類物質(zhì)定量分析

按照所建立的UPLC-ESI-MS方法，依據(jù)保留時間等信息，結(jié)合表1中14種酚酸標準品回歸方程，計算出猴頭菇醇提物及4種有機溶劑萃取物中14種酚酸含量如表2所示。

從表2可以看出，猴頭菇醇提物及4種有機溶劑萃取物中酚酸組成較一致，但組分含量差異明顯。EE中含量較高的為苯甲酸和反式肉桂酸，PEF中含量較高的為苯甲酸、肉桂酸、沒食子酸，CF中含量最高的為苯甲酸、反式阿魏酸、反式肉桂酸，EAF中含量較高的為反式阿魏酸、苯甲酸、原兒茶酸，NF中含量較高的為苯甲酸、沒食子酸。相對于其他酚酸組分，苯甲酸在EE、PEF、CF和 NF中的含量均為最高，分別為202.951、1 209.208、3 512.186、78.219 μg/100 mg，四者之間存在極顯著性差異（P＜0.01）。而EAF中反式阿魏酸含量最高，其含量為857.464 μg/100 mg。有報道指出，苯甲酸在酸性條件下具有很好的抑菌作用[20]，Rezaeiroshan等[21]指出反式阿魏酸是一種重要的具有生物活性的膳食多酚，具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生理功能，由此推測猴頭菇醇提物及4種有機溶劑萃取物在抑菌、抗炎等方面具有一定的應(yīng)用價值，后續(xù)會對此進行驗證。

表2 猴頭菇醇提物及不同有機萃取物中酚酸類物質(zhì)組成及含量Table 2 Composition and content of phenolic acids of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus

2.3 猴頭菇醇提物及不同有機萃取物中黃酮類物質(zhì)定量分析

按照所建立的UPLC-ESI-MS方法，依據(jù)保留時間等信息，結(jié)合表1中12種黃酮類物質(zhì)標準品回歸方程，計算出猴頭菇醇提物及4種有機溶劑萃取物中12種黃酮類物質(zhì)含量如表3所示。

表3 猴頭菇醇提物及不同有機萃取物中黃酮類物質(zhì)組成及含量Table 3 Composition and content of flavonoids of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus

由表3可知，猴頭菇醇提物及4種有機相黃酮組成和含量差異明顯，且黃酮含量遠遠低于酚酸含量。相對于其他黃酮組分，L-苯丙氨酸在EE、PEF、CF和NF中含量均為最高，其中EE、PEF、CF、NF中L-苯丙氨酸含量分別為 25.688、36.104、6.838、24.080 μg/100 mg。而EAF中表兒茶素含量最高，其含量為0.740 μg/100 mg。

相關(guān)研究表明食用菌中酚類物質(zhì)的組成主要為酚酸和黃酮。Liu等[22]研究指出雙孢菇中的酚類物質(zhì)主要為咖啡酸、沒食子酸、阿魏酸、原兒茶素和楊梅素。Woldegiorgis等[23]研究表明硫磺菌中主要的酚類物質(zhì)為對羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、對香豆酸、綠原酸、沒食子酸和楊梅素。石芳等[24]研究表明黑脈羊肚菌中主要含沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、蘆丁、阿魏酸、白藜蘆醇、木犀草素、槲皮素等酚類物質(zhì)。本試驗結(jié)果檢測出的猴頭菇中的酚類物質(zhì)大部分為酚酸，少部分為黃酮，且酚酸和黃酮的組成和含量均存在差異。這種差異可能與提取試劑的極性有關(guān)，極性不同導(dǎo)致酚類物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性不同，提取率也不同。大量的研究已經(jīng)表明，提取溶劑的極性與酚類化合物的提取率有關(guān)。董蕊等[25]研究了木賊醇提物及不同萃取部位總酚酸、黃酮的含量，結(jié)果表明乙酸乙酯相總酚酸和黃酮的相對含量高于石油醚、正丁醇和水相。涂宗財?shù)萚26]比較了紅薯葉在不同溶劑（水、甲醇、無水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯和氯仿）中總酚和總黃酮的含量，結(jié)果表明甲醇中總酚和總黃酮含量最高。劉曦等[27]研究了藍莓葉不同極性提取劑對總酚含量的影響，結(jié)果表明水提物中總酚含量最高。由此可見提取溶劑的極性對酚類物質(zhì)提取率有較大的影響，不同植物的酚類物質(zhì)組成不同，提取率也存在差異。因此要得到更全面的猴頭菇酚類物質(zhì)組成，需要進一步優(yōu)化質(zhì)譜條件和利用更高級的串聯(lián)質(zhì)譜進行對未檢測的其他比較復(fù)雜的酚類物質(zhì)和衍生物進行分析。

3 結(jié)論

本研究建立了24種酚類化合物的超高效液相色譜－電噴霧質(zhì)譜法，并用所建立的方法分析了猴頭菇醇提物及不同有機溶劑萃取物中酚類物質(zhì)的組成和含量。相對于其他酚酸和黃酮組分，苯甲酸和L-苯丙氨酸在EE、PEF、CF和NF中的含量均為最高，反式阿魏酸和表兒茶素在EAF中含量最高。猴頭菇醇提物及不同有機溶劑萃取物中的酚酸和黃酮組分的含量均存在一定的差異，EE中主要含苯甲酸、反式肉桂酸和L-苯丙氨酸，PEF中苯甲酸、肉桂酸、沒食子酸和L-苯丙氨酸含量相對較高，CF中含量最高的為苯甲酸、反式阿魏酸、反式肉桂酸和L-苯丙氨酸，EAF中主要酚類組分為反式阿魏酸、苯甲酸、原兒茶酸和表兒茶素，NF中含量較高的為苯甲酸、沒食子酸和L-苯丙氨酸。這為進一步研究猴頭菇中酚類物質(zhì)提供了理論依據(jù)，對猴頭菇中活性成分的開發(fā)與利用具有參考意義。