李遠威 郝凱越 宗永臣 尤俊豪 郭明哲

(西藏農牧學院水利土木工程學院，西藏 林芝 860000)

目前我國城鎮污水處理廠主要采用活性污泥法[1]，其中A2/O工藝由于運行管理簡單、脫氮除磷效果好等應用最為廣泛。污水處理工藝中脫氮除磷的效能與微生物菌屬功能、基因豐度以及各污染物代謝途徑緊密相關。康小虎[2]98研究發現，在亞高原地區污水處理工藝中污水種類可影響功能蛋白種類，且豐度較高的酶和基因與微生物參與的碳代謝、氮代謝以及適應環境變化方面的代謝有著密切的聯系。黃瀟[3]發現，在污水處理好氧區主要發生氮代謝，且水力停留時間(HRT)的延長有利于脫氮菌和有機物降解菌的生長，便于碳源、氮源的降解。彭永臻等[4]在活性污泥中發現固氮酶功能基因nifD，其主要參與的氮代謝途徑是生物脫氮的主體。崔迪[5]發現，活性污泥中以碳、氮和磷代謝為主，其中碳代謝提供的碳源確保了微生物群落的基本生長要求，便于后續生物代謝反應的進行。然而，上述研究多在平原或亞高原地區展開，針對高原生境下活性污泥代謝途徑和基因豐度等方面的研究較少。西藏自治區位于青藏高原西南部，平均海拔在4 000 m以上，為進一步提升高原生境下污水處理效能，本研究在西藏農牧學院校區內構建A2/O工藝試驗裝置，考察了在不同HRT條件下污泥系統的優勢菌屬功能和污染物代謝途徑等情況，探討了微生物代謝功能等規律，以期為高原生境下活性污泥微生物代謝機制的研究提供一定的理論基礎。

1 試驗和方法

1.1 試驗裝置

試驗采用A2/O工藝小試裝置，其中反應池總體積為210 L，其中厭氧池、缺氧池、好氧池體積分別為35、58、117 L，二沉池體積為39 L。試驗過程中，厭氧池和缺氧池利用爪極式永磁同步電機配合攪拌器進行攪拌，好氧池利用交直流增氧泵和空氣浮子流量計進行曝氣[6]。采用磁力驅動循環泵控制污泥回流比為100%，采用蠕動泵控制硝化液回流比為200%。利用好氧池進行35 d的活性污泥培養，培養條件為：溫度(20.0±0.5) ℃，溶解氧(DO) 2.0～3.0 mg/L，pH 6.50～7.50。培養階段結束時，測得污泥沉降比(SV30)為28%，混合液懸浮固體質量濃度(MLSS)為3 716 mg/L，污泥達到預定要求后開展正式試驗。本試驗直接采用校園生活污水為試驗用水，主要進水水質指標見表1。

表1 試驗用水水質指標

1.2 試驗方法

保持污泥培養階段時的控制指標不變，利用流量計調節進水流量分別為8、10、12、14 L/h，對應的HRT為26.25、21.00、17.50、15.00 h，每種HRT工況連續運行9 d，每天持續監測進出水COD、TN、TP、氨氮指標，檢測方法參照文獻[7]。試驗結束后對好氧池活性污泥進行取樣，預處理后送樣檢測。為消除工況調整的影響，每一工況運行結束后間隔72 h后開展下一工況試驗。

1.3 活性污泥預處理及分析

1.3.1 活性污泥樣品預處理

采集好氧池中泥水混合液裝入已滅菌的離心管中，利用高速臺式冷凍離心機以3 000 r/min離心15 min對活性污泥進行富集[8]，然后置于超低溫冷凍儲存箱-80 ℃冷凍24 h，進行高通量16S rRNA基因測序分析。

1.3.2 測序分析流程

首先利用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提DNA，設計引物接頭并利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增與產物純化，對指定區域合成barcode特異引物。將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量工藝進行檢測，利用Illumina技術進行16S rRNA測序分析。

2 結果與討論

2.1 進水水質及污染物去除率分析

不同HRT工況下A2/O工藝平均進出水水質及污染物去除率見表2。

表2 不同HRT下平均進出水水質及污染物去除率

由表1可見，當HRT為26.25 h時，出水COD達到了《城鎮污水處理廠污染物排放標準》(GB 18918—2002)一級A標準(50 mg/L)[9]，此時COD去除率最高為85.90%，其余各工況出水均未達到GB 18918—2002一級B標準(60 mg/L)。TN在各HRT工況下均達到了GB 18918—2002一級A標準(15 mg/L)，但在HRT為21.00 h時TN去除率最高，達到73.68%。TP在各HRT工況下出水均滿足一級B標準(1.5 mg/L)，其中在HRT為26.25 h時去除率最高(81.54%)。出水氨氮在4種HRT工況下均達到GB 18918—2002一級A標準(5 mg/L)，在HRT為15.00 h時去除率最高(93.17%)。綜合上述分析可知，TN和氨氮出水水質均滿足GB 18918—2002一級A標準，即表明HRT的長短對TN和氨氮的去除無明顯影響；COD在HRT為26.25 h時去除效果最好，這與郝凱越等[10]研究一致。綜合考慮氨氮雖在HRT為15.00 h時處理效果最好，但此時COD去除效果較差，而HRT為26.25 h時4種污染物均有較好的去除效果，故優先選擇26.25 h為最佳的HRT運行工況，以便高效地去除污染物。HRT的變化會影響微生物群落多樣性指數變化[11-12]和功能菌屬豐度變化[13]，微生物群落的變化可以進一步導致出水水質發生變化。

2.2 A2/O工藝好氧池優勢菌屬功能分析

采用SPSS 22.0軟件依據silva數據庫對4個HRT工況下好氧池的污泥樣本展開統計分析，利用核糖體數據庫項目(RDP)分類和功能預測軟件(PICRUSt)篩選出已知功能分類和代謝類型的前10種菌屬，詳細信息見表3。

由表3可見，腐螺旋菌屬[14]、鞘脂菌屬[15-16]和克里斯滕森菌科R-7群[17]為有機物降解菌；奧托氏菌屬[18]、孤島桿菌屬[19]、norank_f_JG30-KF-CM45和貪食菌屬[20]為反硝化菌；熱單胞菌屬[21]和產黃桿菌[22]為雙重屬性菌，既可以利用反硝化作用脫氮又可利用聚磷菌特有的聚磷功能除磷；戈登氏菌屬為典型聚磷菌，在污水處理除磷功能中占據主導地位。綜上可知，優勢菌屬主要代謝功能為有機物降解、反硝化脫氮和聚磷菌除磷。

表3 A2/O工藝好氧池前10種優勢菌屬功能分類

2.3 微生物群落代謝途徑分析

2.3.1 A2/O活性污泥微生物群落主要代謝途徑

為了進一步研究A2/O工藝中微生物群落各污染物代謝途徑，通過與京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫中基因功能比較，共獲得239條代謝途徑，篩選出豐度最大的前10條代謝途徑并對代謝功能信息進行注釋，不同HRT工況下各種代謝途徑豐度值信息見表4。

表4 活性污泥微生物群落前10條代謝途徑豐度

由表4可見，不同HRT工況下豐度最高的代謝功能為ABC轉運蛋白(ko02010)，說明微生物細胞運輸各類污染物、無機鹽離子等物質較多，保證了各污染物代謝所需的營養條件；其次為細菌雙組分調節功能(ko02020)，其主要作用為及時響應外界環境變化，做出利于自身生長的變化，在適應環境變化中有顯著作用[23]，該代謝途徑豐度僅次于ABC轉運蛋白，顯然在應對高原獨特的環境中發揮著重要作用。嘌呤代謝(ko00230)、核糖體功能(ko03010)、嘧啶代謝(ko00240)等豐度也較高，均與污染物去除密切相關。此外，氧化磷酸化(ko00190)是磷代謝的主要途徑；丁酸代謝(ko00650)和丙酮酸代謝(ko00620)是碳代謝的主要途徑；精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330)以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)等是典型的氮代謝的主要途徑之一。綜上可知，高原生境下不同HRT工況的A2/O工藝中主要代謝途徑為碳氮磷的代謝。代謝途徑豐度的不同表明了微生物群落結構的不同，調節HRT導致了A2/O工藝中群落結構發生變化，不同群落結構組成導致了各污染物去除效果的好壞。從表4可以看出，HRT為26.25 h時各種代謝途徑的豐度均最大，此時各種污染物代謝反應迅速，細胞新陳代謝活動最活躍，污染物處理效能最佳。

2.3.2 微生物群落碳代謝途徑

分析活性污泥樣品中的功能基因，發現5 582個功能基因參與各污染物的代謝途徑，選取參與碳代謝途徑的前10種功能基因并對其代謝途徑進行分析，具體信息見表5。

由表5可見，碳代謝途徑主要集中在脂肪酸代謝(ko00071)、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(ko00280)、脂肪酸生物合成(ko00061)、糖酵解/糖異生(ko00010)和丙酮酸代謝(ko00620)等途徑[24]，脂肪酸、糖類和脂質代謝途徑較多，與生活污水常見成分相關。本研究中試驗用水碳氮比在8.30～11.62波動，確保了充足的碳源供應，因此碳代謝途徑十分豐富。酶功能分類主要集中在脫氫酶、水合酶、還原酶、轉移酶等。酶類分布以脫氫酶豐度最大，說明細胞代謝反應以氧化還原反應為主，主要消耗各類有機污染物，為細胞間的生命活動提供充足的碳源，也可高效去除污水中的有機物。其余酶類種類較多，表明微生物內部其他各類酶促反應較多，為微生物細胞的生命活動提供了生存環境和能源供應。

表5 碳代謝途徑的前10種功能基因

2.3.3 微生物群落氮代謝途徑

生活污水中氮素的含量較高，脫氮的過程一般為硝化反應、反硝化反應與氨化反應[25-27]，即主要通過硝化菌、反硝化菌(DNB)和氨氧化菌(AOB)將有機氮轉變為氮氣，這也是污水處理中主要的生物脫氮途徑。選取參與氮代謝途徑前10種功能基因并對其代謝途徑進行分析，具體信息見表6。

由表6可見，氮代謝途徑主要集中在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(ko00250)、氮代謝(ko00910)和精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330)等途徑。與氮代謝相關的基因和酶參與氨基酸的合成分解代謝、硝化、反硝化和氨化反應一致，說明微生物細胞的氮代謝途徑種類多且豐度較大，有利于以氨基酸為底物的生化反應的進行。另外，細菌雙組分調節(ko02020)代謝途徑的基因豐度最大，表明微生物細胞應對環境變化能力強。酶類分布以合成酶、脫氫酶和酸合酶為主，其中豐度最大的是合成酶，表明氮代謝途徑主要以氨基酸代謝為主，通過合成氨基酸類物質，為構造大分子蛋白質提供物質基礎，不斷完善微生物脫氮系統的完整性從而消耗污水中的氮素。

表6 氮代謝途徑的前10種功能基因

2.3.4 微生物群落磷代謝途徑

生物除磷的主要途徑是依靠聚磷菌聚磷，以此來消耗污水中的磷元素從而達到除磷的目的[28]。選取參與磷代謝途徑前10種功能基因并對其代謝途徑進行分析，具體信息見表7。

由表7可見，磷代謝主要途徑是氧化磷酸化(ko00190)，參與磷代謝的基因都具備此項代謝途徑。其中F型轉運H+的ATP酶類數量和種類最多，表明轉運ATP酶類數量多且對應基因豐度較大，其主要為細胞代謝和生命活動提供充足的能源支撐，從而使細胞利用氧化磷酸化途徑來消耗污水中的磷。另外，氧化酶和脫氫酶數量也占據一定比例，在好氧條件下氧化磷酸化反應速度快，聚磷菌的微生物代謝較快，為除磷提供了有力的條件，導致除磷效果的提高。

表7 磷代謝途徑的前10種功能基因

2.4 A2/O工藝微生物功能基因豐度分析

將污泥樣品基因數據信息與KEGG數據庫中已知基因數據進行比對，發現5 752個同源基因，選取不同HRT下活性污泥群落微生物細胞豐度排在前10的功能基因并對其名稱和基因功能進行分析，具體信息見表8。

由表8可見，本研究豐度排名前10的功能基因中有7個與亞高原地區城市污水系統的功能基因相同[2]103，其中rpoE基因是革蘭氏陽性調節基因，主要面對外界環境的變化作出反應，便于適應當前生存環境，且該基因豐度明顯高于亞高原地區，推測因高原特殊生境造成該基因不斷表達自身基因功能來適應高原特殊生境。ABC.CD.P、ABCB-BAC和ABC.CD.A屬于轉運系統蛋白基因，主要與各污染物的轉化和分解有關。paaF和echA基因的產物是烯酰輔酶A水合酶，主要作用是參與氨基酸降解和碳固定等多種碳、氮代謝途徑。fabG、OAR1基因的產物是3-氧代酰基-[酰基載體蛋白]還原酶，該酶主要參與碳代謝途徑。drrA基因的產物是抗生素轉運系統ATP結合蛋白，主要作用是減輕抗生素對細胞的毒性，使細胞群落適應在抗生素環境中生存。另外，高原生境下特有的功能基因號有：K02014(TC.FEV.OM)、K00626(ACAT、atoB)、K00257(mbtN、fadE14)。TC.FEV.OM基因的產物是鐵復合物外膜受體蛋白，主要作用是污染物利用該受體蛋白進入細胞內完成污染物的降解。ACAT、atoB基因的產物是乙酰輔酶A C-乙酰轉移酶，該酶主要參與各種氨基酸代謝的氮代謝途徑。mbtN、fadE14的產物是酰基ACP脫氫酶，主要參與氧化還原反應降解污染物。豐度前10的功能基因中僅有3個碳代謝優勢基因存在，氮和磷代謝優勢基因均不存在，即在基因水平仍以碳代謝途徑為主。由以上分析可知，高原生境下A2/O工藝活性污泥微生物功能基因中以碳代謝途徑的基因偏多，基因豐度相對最大，說明在各好氧池中有機物去除功能較完善。另外，不同HRT下功能基因豐度排序為26.25 h>17.50 h>15.00 h>21.00 h，表明HRT為26.25 h時活性污泥系統功能基因發生基因轉錄、翻譯等過程最多，參與各種蛋白質表達和污染物代謝的功能越強大。因此，在基因水平上進一步說明26.25 h是最佳的HRT運行工況。

表8 不同HRT下活性污泥群落微生物細胞主要功能基因豐度

3 結 論

對高原生境下A2/O工藝污染物去除效果及好氧池中活性污泥優勢菌功能、代謝途徑和基因豐度進行分析，探討不同HRT工況下A2/O工藝微生物代謝機制，結果表明：高原生境下，A2/O工藝HRT為26.25 h污水處理效果最好，微生物優勢菌屬代謝功能以有機物降解、反硝化脫氮和聚磷菌除磷為主，這與污水中常含此類污染物有關；微生物群落代謝途徑分析可知，應對環境變化的細菌雙組分調節(ko02020)豐度較大，該代謝途徑在適應環境變化中有顯著作用，并在HRT為26.25 h時達到最大值，是高原生境下的優勢代謝途徑；根據功能基因豐度分析，發現高原生境下活性污泥微生物細胞中rpoE基因豐度偏大，凸顯高原生境對優勢基因功能有一定的選擇性， HRT為26.25 h時微生物中細胞功能基因豐度最大，即發生基因轉錄、翻譯等過程最多，參與各種蛋白質表達和污染物代謝的功能越強大，進一步證實了優勢菌屬功能和代謝途徑豐度最大的原因，與水質分析結果一致。因此，26.25 h是高原生境下A2/O工藝最佳的HRT運行工況。