采用體外染色體畸變試驗檢測銳鈦型納米二氧化鈦的遺傳毒性

杜秀明，洪麗玲，徐靈芝，周慶云，*

(1．上海化工研究院有限公司，上海 200062；2．上海化工院檢測有限公司，上海 200062)

納米二氧化鈦亦稱鈦白粉，直徑通常在100 nm以下，主要有兩種結晶形態：銳鈦型(anatase)和金紅石型(rutile)。金紅石型二氧化鈦具有較高的硬度、密度、介電常數及折射率，其遮蓋力和著色力也較高。銳鈦型二氧化鈦在可見光短波部分的反射率較高，并且對紫外線的吸收能力比金紅石型低。在一定條件下，銳鈦型二氧化鈦可轉化為金紅石型二氧化鈦。因其具有獨特的物理化學性質而被廣泛用于各種領域，包括油漆、化妝品和醫藥產品等，但其安全性一直是討論的焦點[1]。在Ames試驗、彗星試驗、微核試驗、染色體畸變試驗和基因突變試驗等系列遺傳毒性試驗中，它們的遺傳毒性試驗結果各不相同[2-3]，體外和體內試驗均有陽性和陰性結果的報道[4-5]。

一項體內研究表明，納米二氧化鈦在彗星試驗和微核試驗中可以誘導細胞微核的產生，并引起體細胞DNA缺失[6]；而另一項體內研究卻給出了陰性結果，原因可能是后者采用吸入染毒方式，導致內暴露濃度比前者低很多[7]。Shukla和Petkovic等[8-9]的體外研究表明，納米二氧化鈦可以誘導體外培養的細胞微核率升高，并引起體外培養細胞的DNA損傷。Guichard等[10]的體外研究則表明納米二氧化鈦不能引起敘利亞金倉鼠胚胎細胞微核率的升高。Wang等[11]的研究表明，在體外彗星試驗和Hprt基因突變試驗中，納米二氧化鈦未引起體外培養細胞的DNA損傷。

根據《OECD化學品測試準則473：體外哺乳動物染色體畸變測試》，采用中國倉鼠肺(Chinese hamster lung，CHL)細胞進行體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗是常用的生物測試體系之一，也是遺傳毒性組合策略試驗之一[12]。該試驗可以確定和評價化學品引起體外培養的哺乳動物細胞染色體畸變的能力，從而判斷受試物是否屬于致突變物。染色體結構畸變可分為兩種類型：一種是染色體類型畸變，表現為同一位點的兩條染色單體的斷裂或斷裂重組；另一種是染色單體類型畸變，表現為染色單體的斷裂或斷裂重組。

我們前期的研究表明，銳鈦型納米二氧化鈦未引起小鼠淋巴瘤細胞基因突變頻率的升高，在基因突變試驗中呈陰性結果[13]。此外，尚未見銳鈦型納米二氧化鈦(40 nm)能否引起中國倉鼠肺細胞染色體畸變的相關報道。為了進一步驗證銳鈦型納米二氧化鈦的安全性，本研究通過體外染色體畸變試驗來檢測銳鈦型納米二氧化鈦誘發遺傳毒性的可能性，為納米二氧化鈦在化妝品及食品領域的安全使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

銳鈦型納米二氧化鈦購買于上海麥克林生物化學有限公司；ZEISS Merlin掃描電子顯微鏡用于表征納米二氧化鈦的顆粒；秋水仙堿、絲裂霉素C和環磷酰胺均購自Sigma公司；NADP-Na2和G-6-P-Na2購自北京陽光生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

中國倉鼠肺細胞購于中國科學院上海生命科學研究所細胞庫。采用RPMI-1640培養液，細胞培養于37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中。

1.3 受試物濃度的選擇

銳鈦型納米二氧化鈦不溶于去離子水、二甲亞砜或其他溶劑，因此選擇RPMI-1640(不含胎牛血清)作為制備混懸液的溶劑。將5個濃度(0.007 8、0.031 2、0.125、0.5和2 mg/mL)的銳鈦型納米二氧化鈦混懸液超聲處理10 min，然后用于測試細胞毒性。染毒24 h后根據各組細胞濃度計算細胞相對增殖率(relative increase in cell counts，RICC)，確定體外染色體畸變試驗的染毒濃度。

細胞相對增殖率=(處理組收獲時的細胞總數-接種時細胞總數)/(溶劑對照組收獲時的細胞總數-接種時細胞總數)×100%

細胞抑制率=1-細胞相對增殖率

1.4 染毒處理

將細胞懸液分別加入新的培養瓶內，每瓶CHL細胞數約為10×105個，再分別加入不同濃度(0.007 8、0.031 2、0.125、0.5和2 mg/mL)的銳鈦型納米二氧化鈦混懸液或陽性參照物(絲裂霉素C或環磷酰胺)及0.5 mL的S9混合液(不加S9時，用培養基補足)，補加完全培養基(含10%胎牛血清的培養液)至10 mL。

試驗分為有代謝活化系統短時處理組(+S9，4 h)、無代謝活化系統短時處理組(-S9，4 h)和無代謝活化系統連續處理組(-S9，24 h)3種處理方式，每種處理方式均設溶劑對照組和陽性對照組，溶劑對照組加同體積的樣品溶劑(RPMI-1640)，陽性對照組加同體積的陽性物，所有組別均設2個平行。

1.5 染色體制備和鏡檢

收獲細胞前，加入適量秋水仙素，培養大約3 h。然后棄上清液，用少量滅菌生理鹽水洗滌2次，再用胰酶消化，離心，棄上清。細胞經低滲、預固定、固定后，每組制片2張。玻片經染色、封片后，進行鏡檢。每個濃度組觀察300個背景清晰、分散良好、染色體收縮適中的中期分裂相細胞，鏡檢結束后進行數據匯總并統計分析。

1.6 統計分析

數據采用卡方檢驗對各組染色體畸變率進行統計學分析，P＜0.05表示組間比較的差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 納米二氧化鈦的粒徑和細胞毒性

ZEISS Merlin掃描電子顯微鏡下銳鈦型納米二氧化鈦的粒徑約40 nm，如圖1所示。

圖1 銳鈦型納米二氧化鈦粒徑由ZEISS Merlin掃描電子顯微鏡表征

預試驗確定銳鈦型納米二氧化鈦在濃度為2 mg/mL時對CHL細胞的細胞毒性小于50%。依據OECD指導原則473，選擇2 mg/mL作為最高測試濃度[14]。

細胞相對增殖率用于評估銳鈦型納米二氧化鈦的細胞毒性，CHL細胞相對增殖率隨銳鈦型納米二氧化鈦濃度的升高而降低。銳鈦型納米二氧化鈦在最高濃度為2 mg/mL時，(-S9，4 h)、(+S9，4 h)和(-S9，24 h)3種處理方式下的細胞相對增殖率分別為70.32%、72.33%和64.80%，具體見表1。所有染毒濃度組的細胞相對增殖率均超過50%，表明各組細胞抑制率低于50%。依據OECD指導原則473，試驗選用的濃度適用于本研究。

表1 銳鈦型納米二氧化鈦的細胞毒性試驗結果

2.2 納米二氧化鈦的遺傳毒性

各濃度組染色體畸變頻率見表2。

表2 銳鈦型納米二氧化鈦的染色體畸變試驗結果

試驗樣品在0.007 8、0.031 2、0.125、0.5和2 mg/mL濃度下，無代謝活化系統短時處理組(-S9，4 h)不含裂隙的染色體畸變率分別為1.67%、1.33%、2.00%、1.00%和2.33%，有代謝活化系統短時處理組(+S9，4 h)不含裂隙的染色體畸變率分別為1.33%、1.33%、2.00%、1.67%和2.00%，無代謝活化系統連續處理組(-S9，24 h)不含裂隙的染色體畸變率分別為1.33%、1.67%、2.00%、1.67%和2.33%，與溶劑對照組相比，差異均無統計學意義(P＞0.05)。陽性對照組(-S9，4 h)、(+S9，4 h)和(-S9，24 h)3種處理方式下觀察到不含裂隙的染色體畸變率分別為25.33%、26.67%及29.33%，與溶劑對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)。油鏡下觀察的中期分裂相染色體形態如圖2。

圖2 油鏡下觀察的中期分裂相染色體形態

3 討論

在有和無代謝活化系統處理條件下，各染毒濃度組銳鈦型納米二氧化鈦在體外染色體畸變試驗中均為陰性結果，表明銳鈦型納米二氧化鈦在本測試濃度范圍內，對CHL細胞染色體無致畸作用。

本研究結果與我們先前基因突變試驗的研究結果一致[13]。Woodruff等[15]的研究也表明銳鈦型納米二氧化鈦不會引起TK雜合子細胞DNA斷裂或氧化性DNA損傷，也不會引起沙門氏菌菌株TA102、TA100、TA1537、TA98和TA1535明顯的細菌回復突變。Warheit等[16]的研究也表明納米二氧化鈦在細菌回復突變試驗和中國倉鼠卵巢細胞的體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗中呈陰性結果。一項長期致突變試驗表明，即使納米二氧化鈦顆粒(80%銳鈦型和20%金紅石型的混合物)在肝臟中停留很長時間，對肝臟細胞仍無致突變作用[17]。Theogaraj等[18]的研究也表明銳鈦型納米二氧化鈦和金紅石型納米二氧化鈦對中國倉鼠卵巢細胞均無光遺傳毒性，在接收紫外照射下也沒有引起細胞染色體畸變頻率的增加。馬茂才等[19]的研究也表明銳鈦型納米二氧化鈦不會引起沙門氏菌菌株TA97、TA198、TA100和TA102明顯的細菌回復突變。然而，一些其他研究表明納米二氧化鈦具有遺傳毒性，包括Di Virgilio等[20]發現中國倉鼠卵巢K1細胞中微核頻率呈濃度依賴性增加。Lu等[21]也發現納米二氧化鈦可以引發同一細胞系中微核頻率的增加。另一項研究表明，銳鈦型納米二氧化鈦對大鼠有血液毒性，能夠誘發體細胞遺傳毒性并引起免疫毒性改變[22]。造成上述結果差異的原因可能有研究用生物測試體系不同、納米二氧化鈦晶體類型不同、納米二氧化鈦粒徑大小不同以及染毒方式不同等。

綜上所述，結合我們之前的研究，從基因和染色體水平分析，銳鈦型納米二氧化鈦(40 nm)不能誘發體外培養的哺乳動物細胞染色體畸變和基因突變，不屬于致突變物。此外，因判斷物質是否屬于致突變物的復雜性以及體外測試系統的局限性，還需進一步進行體內遺傳毒性測試以確定銳鈦型納米二氧化鈦是否具有遺傳毒性。