不同溫度下AOX和COX途徑對苜蓿種子萌發和幼根生長的影響

趙文靜, 張浩陽, 徐燕妮, 羅 蛟, 劉美君*

(1.新疆農業大學草業學院， 新疆草地資源與生態重點實驗室， 西部干旱荒漠區草地資源與生態教育部重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052； 2.山東農業大學生命科學學院， 作物生物學國家重點實驗室， 山東 泰安 271018)

苜蓿(MedicagosativaL.)作為重要的多年生優質豆科牧草，其產業對我國經濟發展和生態環境建設與保護起著重要的作用[1]。紫花苜蓿廣泛分布于我國西北、華北、東北等地，也是新疆分布最廣的栽培牧草，在南北疆平原和山區均有分布[2]，然而由于新疆春秋氣溫低且不穩定，夏季高溫炎熱，導致一些優良的紫花苜蓿品種在生長發育階段易遭受低溫或高溫的影響，這嚴重降低了苜蓿的產量和質量。

種子萌發在植物繁衍和種群更新中起著至關重要的作用，故其對作物的生長和產量有重要的影響[3]。溫度是影響種子萌發生長的關鍵環境因子之一，外界溫度過高或過低均會顯著降低種子的萌發活性，導致種子萌發生理發生變化[4-5]。萬茜等研究發現，高、低溫脅迫都會導致豇豆(Vignaunguiculata)幼苗體內丙二醛含量的上升，但其體內可溶性蛋白質含量、過氧化物酶、過氧化氫酶活性變化不一致[6]。肖夢穎等研究發現，高粱種子萌發時，遭受低溫脅迫會導致超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性上升[7]。溫度與其它脅迫結合會加重對種子萌發的抑制[8-11]。然而，目前有關紫花苜蓿種子萌發的研究主要集中在抗寒[12]、干旱[13]、鹽堿[14-15]等方面，而有關高、低溫脅迫對苜蓿種子萌發的影響研究較少，且研究不深入。

種子萌發是一個需能的過程，線粒體呼吸代謝是種子萌發的唯一能量來源。植物呼吸代謝具有多樣性，除了糖酵解途徑(Glycolysis pathway，EMP)，磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway，PPP)，三羧酸循環(Tricarboxylic acid cycle，TCA)3條主要的呼吸途徑外，交替氧化酶(Alternative oxidase，AOX)途徑和細胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase，COX)途徑也是植物呼吸代謝的2條重要途徑。前人研究表明，在適宜植物種子萌發溫度下，AOX和COX途徑均在種子萌發過程中發揮重要作用，水稻(Oryzasativa)種子剛長出胚芽和胚根時，COX的活性會達到高峰[16]，甜菜(BetavulgarisL.)種子的吸脹萌發與COX的活性大小密切相關[17]；也有研究認為AOX途徑在鷹嘴豆(Cicerarietinum)、棉花(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycinemax)種子的萌發過程中起關鍵作用[18-20]。

然而，目前針對線粒體AOX和COX途徑在不同溫度下對種子萌發的作用的研究較少，而且溫度是否會影響AOX和COX途徑對種子萌發的作用尚不清楚。因此，本研究以‘甘農5號’和‘新牧4號’紫花苜蓿為供試材料，分別采用水楊基氧羥肟酸(SHAM)、氰化鈉(NaCN)專一性抑制劑部分抑制AOX和COX途徑，探究了不同溫度下AOX和COX途徑對種子發芽速率和幼根生長的影響。闡明這一問題將豐富我們對種子萌發機制的理解，而且研究不同溫度下不同秋眠級紫花苜蓿種子萌發的生理機制，對苜蓿品種的引種選育具有較強的實際意義，對草地的建植以及維持草地生態功能有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以‘甘農5號’(GN5)和‘新牧4號’(XM4)紫花苜蓿為試驗材料，其中XM4由新疆農業大學草業學院2018年收獲并提供，GN5由甘肅農業大學草業學院2018年收獲并提供，且2種紫花苜蓿的發芽率均在95%以上，至2019年3月進行試驗前2種紫花苜蓿都存放于新疆農業大學牧草種子庫。

1.2 試驗設計

2種紫花苜蓿各選取50粒顆粒飽滿[21]，大小均勻的種子，用75%的酒精消毒約30 s，然后用無菌蒸餾水沖洗3次后將種子整齊的置于直徑為90 mm鋪有雙層濾紙的培養皿中，每個培養皿中加入3 mL去離子水或者處理溶液，最后將培養皿置于光周期12 h·d-1，光照強度為50 μmol·m-2·s-1的恒溫培養箱中。

由于新疆位于我國西北內陸(73°E～96°E，34°N～48°N)，屬溫帶大陸性氣候，氣溫溫差大，歷史上夏季最高氣溫為41℃，春季最低氣溫為-28℃。因此在預試驗中分別設置了5℃，15℃，25℃，35℃，40℃5個溫度梯度進行了種子萌發的預試驗，并最終選取10℃，25℃，40℃進行正式試驗，每個溫度下每個試劑處理設置3個重復，共計63個培養皿。自種子置培養皿之時開始計時，每24 h觀察記錄種子的萌發情況，以胚根突破種皮露白作為萌發的標準[22]，持續觀察5 d，期間每48 h更換一次濾紙，并補充3 mL相應的處理溶液，5 d后每個培養皿隨機選擇10株幼苗，用游標卡尺測量其根長。

本試驗共設置7種不同的處理(詳見表1)，其中SHAM不溶于水，需要乙醇助溶。

表1 7種不同的試劑處理對紫花苜蓿種子萌發和幼根生長的影響Table 1 Effects of 7 different reagent treatments on seed germination and root growth of alfalfa

1.3 測定指標

種子萌發指標按如下計算公式。

(1)發芽率(%)=當天發芽種子數/供試種子數×100%[25];

(2)發芽抑制率=(第n d CK下的發芽率-第n d處理組的發芽率)/第n d CK下的發芽率×100%，n=5[26];

(3)根長抑制率=(第6 d CK的根長—第6 d處理的根長)/第6 d CK的根長×100%[27]。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2003軟件整理數據，SPSS 19.0軟件進行單因素方差(ANOVA)統計分析，Duncan法多重比較，差異顯著性定義為P<0.05，采用軟件Sigmaplot 10.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同溫度對紫花苜蓿種子萌發的影響

不同溫度處理下，2種紫花苜蓿的種子均在第3 d完全萌發。與25℃相比，40℃，10℃均顯著降低了種子第1 d和第2 d的發芽率(P<0.05)，但對3 d之后的種子發芽率無顯著影響(圖1)。這表明非適宜溫度會降低紫花苜蓿種子的發芽速率，但對種子最終發芽率無明顯影響，且2種紫花苜蓿品種不同溫度下的發芽率結果基本相似。

圖1 10℃，25℃，40℃下紫花苜蓿種子發芽率的影響Fig.1 Effect of 10℃,25℃ or 40℃ on the germination rate of alfalfa seeds注：圖A為‘新牧4號’，圖B為‘甘農5號’。不同小寫字母表示不同溫度和不同萌發時間下紫花苜蓿發芽率差異顯著(P<0.05)Note:Fig.1A for ‘Xinmu No.4’;Fig. B for ‘Gannong No.5’. Different lowercase letters indicate significant differences in the germination rate of alfalfa under different temperatures and different germination times at the 0.05 level

2.2 不同溫度下AOX和COX途徑受抑制對紫花苜蓿種子發芽速率的影響

由圖2可知，2種紫花苜蓿種子發芽的第1 d，25℃下NaCN和SHAM處理均顯著抑制了XM4和GN5種子的發芽率(圖2B)(P<0.05)。10℃下NaCN處理對2種紫花苜蓿種子的發芽率有著顯著地抑制作用(P<0.05)，而SHAM處理對2種紫花苜蓿種子的發芽率影響不顯著(圖2A)。40℃下，NaCN和SHAM處理均抑制了2種紫花苜蓿種子的發芽率(圖2C)(P<0.05)。同一溫度下NaCN處理對2種紫花苜蓿種子發芽率的影響相似，而SHAM處理對2種紫花苜蓿種子發芽率的影響存在差異。

不同溫度下，種子發芽第5 d時，NaCN處理對2種紫花苜蓿種子發芽的抑制作用消失，但40℃下SHAM處理仍顯著降低了2種紫花苜蓿種子的發芽率(圖2G，H，I)(P<0.05)。

圖2 10℃(A，D，G)，25℃(B，E，H)或40℃(C，F，I)下不同呼吸抑制劑處理對紫花苜蓿種子發芽率的影響Fig.2 Effect of different treatments on the germination rate of alfalfa seeds at 10℃(A,D,G),25℃(B,E,H)or 40℃(C,F,I)注：不同小寫字母表示相同品種同一溫度不同呼吸抑制劑處理下差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences under different respiration inhibitor treatments at the same temperature at the 0.05 level

綜上所述，AOX和COX途徑在苜蓿種子萌發尤其是萌發初期有重要作用，并且溫度會顯著影響AOX和COX途徑對種子萌發的作用。

為了更加清晰的對比AOX和COX途徑對紫花苜蓿種子發芽的影響，本文分析了SHAM和NaCN處理對紫花苜蓿種子萌發過程中每1 d發芽率的抑制比例，并將5 d的抑制比例累加(圖3)，結果表明，25℃下SHAM和NaCN處理種子的發芽抑制率基本相似(圖3C，圖3D)。與25℃相比，10℃下NaCN處理種子的發芽抑制率明顯升高，但SHAM處理種子的發芽抑制率明顯降低(圖3A，圖3B)。與25℃相比，40℃處理小幅提高了NaCN處理種子的發芽抑制率，但是大幅提高了SHAM處理種子的發芽抑制率(圖3E，圖3F)(P<0.05)。這表明，25℃下AOX和COX途徑對紫花苜蓿種子發芽的作用大小相似，10℃下COX途徑對紫花苜蓿種子萌發的作用大，而40℃下AOX途徑對紫花苜蓿種子萌發的作用大；此外，不同溫度下SHAM和NaCN處理對2種苜蓿種子萌發的影響基本一致。

圖3 10℃(A，B)，25℃(C，D)，或40℃(E，F)下不同呼吸抑制劑處理對紫花苜蓿種子發芽的抑制率Fig.3 Inhibition of different respiration inhibitor treatments on the germination of alfalfa seeds at 10℃(A，B)，25℃(C，D)，or 40℃(E，F)注：圖A，C，E為‘新牧4號’，圖B，D，F為‘甘農5號’。不同小寫字母表示同一溫度不同處理下差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一處理不同溫度下差異顯著(P<0.05)Note:Figure A,C,E for ‘Xinmu NO.4’,Figure:B,D,F for ’Gannong No.5’. Different lowercase letters indicate significant differences under different treatments of the same temperature at the 0.05 level,while different capital letters indicate significant differences under different temperatures of the same treatment at the 0.05 level

2.3 不同溫度對紫花苜蓿幼根長的影響

種子萌發后幼根快速生長以吸收水分和養分。在紫花苜蓿生長的第6 d，測定2種紫花苜蓿的幼根長。25℃下紫花苜蓿的幼根最長，10℃和40℃均明顯降低了紫花苜蓿的幼根長(圖4)(P<0.05)，且2種紫花苜蓿間無明顯差異。這說明溫度低于或高于適宜的發芽溫度都會對種子的幼根生長產生抑制作用。

圖4 10℃，25℃，40℃下用去離子水培養第6 d的紫花苜蓿種子幼根長Fig.4 Length of Roots of alfalfa cultivars seedlings was culture in deionized water at 10℃,25℃ and 40℃ for the 6th day注：不同小寫字母表示不同紫花苜蓿在不同溫度下培養第6 d的幼根長差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate that the root lengths of different alfalfa are significantly different on the 6th day of cultivation at different temperatures at the 0.05 level

2.4 不同溫度下AOX和COX途徑受抑制對紫花苜蓿幼根長的影響

在25℃處理下，SHAM和NaCN處理均顯著降低了2種苜蓿的幼根長(圖5B)(P<0.05)；10℃下SHAM處理對2種苜蓿的幼根長度均有明顯的抑制作用，NaCN處理對XM4的幼根長有顯著抑制作用(P<0.05)，但對GN5幼根長的影響并不顯著(圖5A)；40℃下SHAM處理明顯縮短了2種紫花苜蓿的幼根長，2 mmol·L-1的NaCN處理均顯著降低了2種紫花苜蓿的幼根長(圖5C)(P<0.05)，1 mmol·L-1的NaCN處理對2種紫花苜蓿的抑制作用不明顯。

圖5 10℃(A)，25℃(B)或40℃(C)下不同試劑處理對紫花苜蓿第6 d幼根長的影響Fig.5 Effects of different reagent treatments at 10℃(A),25℃(B) or 40℃(C) on the 6th day root length of alfalfa注：不同小寫字母表示同一溫度下不同處理間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences under different treatments of the same temperature at the 0.05 level

為了精確比較2種試劑對幼根生長的影響，本文分析了相對于對照組，SHAM和NaCN處理對紫花苜蓿幼根長的抑制比例。結果表明，在XM4中，與25℃相比，40℃和10℃均明顯加重了SHAM對幼根長的抑制(圖6A)(P<0.05)。在GN5中，SHAM處理對幼根的抑制程度在不同溫度下類似；NaCN處理對幼根長的抑制程度在不同溫度處理下無顯著性差異(圖6B)。另外，在不同溫度處理下，2種紫花苜蓿中SHAM處理導致的幼根長的受抑程度均大于NaCN處理。

圖6 10℃，25℃，或40℃下培養第6 d的紫花苜蓿幼苗的根長抑制率Fig.6 Inhibition rate of different reagent treatments on the 6th day root length of alfalfa at 10℃(A),25℃(B),and 40℃(C)注：圖A為新牧4號，圖B為甘農5號。不同小寫字母表示同一溫度不同處理下差異顯著；不同大寫字母表示同一處理不同溫度下差異顯著(P<0.05)Note:Figure A for Xinmu No.4,Figure B for Gannong No.5.Different lowercase letters indicate significant differences under different treatments of the same temperature at the 0.05 level,while different capital letters indicate significant differences under the different temperatures of the same treatment at the 0.05 level

3 討論

種子萌發是植物生長的第一步，種子萌發從干種子開始吸水膨脹到胚軸突破種皮長成幼苗都離不開植物線粒體的呼吸作用[28]為其提供ATP。植物呼吸有2條重要的電子傳遞鏈，其中COX途徑是植物呼吸電子傳遞的主鏈，為細胞新陳代謝提供能量[29]。而植物特有的AOX途徑，在生物脅迫和非生物脅迫中發揮重要作用[30]。因此，文中利用呼吸途徑專一性抑制劑SHAM，NaCN(所選抑制劑濃度可有效抑制AOX，COX途徑且不會直接影響植物的其他代謝路徑[31-32])對紫花苜蓿的AOX，COX呼吸途徑進行了部分的抑制，結果表明NaCN和SHAM均明顯降低了2種紫花苜蓿種子的發芽速率，這表明AOX和COX途徑均在紫花苜蓿種子萌發中發揮重要作用，這與前人研究結果一致[2,33]。

溫度是影響種子萌發的重要因素之一，不適的溫度常常會影響種子萌發過程中水解酶性質、膜結合蛋白的活力及膜透性等，進而影響種子的發芽速率和胚根、胚芽的生長。本研究以及呂朝燕等[34]的研究都表明萌發溫度過高或過低都會降低種子的萌發活性，影響種子萌發進程。前人研究發現溫度會影響呼吸代謝過程中AOX和COX這2條呼吸途徑，從而影響呼吸代謝，進而影響種子萌發過程[35]，在本研究中發現不同溫度下，2條呼吸途徑對溫度的響應不同，低溫下AOX途徑比COX途徑對紫花苜蓿種子萌發的貢獻小，40℃下則相反。這是因為種子萌發需要大量的ATP維持復雜的生化代謝[36]，而低溫脅迫下，EMP和TCA循環運轉較慢[37]，產生的還原力較少，因此進入呼吸電子傳遞鏈的電子相對不足。此時，高效利用還原力產生盡可能多的ATP是種子萌發面臨的最大挑戰，因此在低溫下抑制COX途徑對種子的萌發速率影響較大。此外，低溫脅迫下AOX途徑對種子萌發的貢獻小于COX途徑，有可能是因為低溫脅迫下AOX的活性降低，增強了線粒體應激信號通路，激發了抗氧化系統的表達[38]，從而維持了低溫下細胞內COX途徑功能的正常運行。與低溫相反，高溫會促進EMP途徑和TCA循環的運轉[39]，從而產生較多的ATP用于種子的萌發，此時COX途徑合成ATP就不再是種子萌發的限制因素。但是高溫會顯著影響酶活以及蛋白復合體的活性，導致呼吸電子傳遞過程中發生電子滲漏，產生大量的ROS，從而造成氧化脅迫[40]。高溫脅迫下，AOX的活性顯著增加，能夠有效的減少ROS的積累[41]，從而減輕高溫對種子萌發的傷害，因此，與COX途徑相比，高溫脅迫下AOX途徑對種子發芽速度的貢獻更高，有效的增加了苜蓿種子發芽的耐熱性。

種子萌發慢意味著幼苗根生長的時間短，因此我們預測溫度和抑制劑對幼根生長與對種子萌發速度的影響類似。但本試驗結果卻發現，AOX和COX途徑在種子萌芽期和幼根生長期的貢獻是不同的，具體表現為與抑制COX途徑相比，AOX途徑受抑制會明顯增加對幼根生長的抑制作用。AOX途徑是非磷酸化途徑，可以快速消耗還原力，從而解除高NADH/NAD+比值對TCA循環的限制[42]。而COX途徑會受到ADP可用性和跨膜電動勢的限制，其活性難以大幅提高[43]。因此AOX途徑比COX途徑能更有效的促進TCA循環。TCA循環是脂肪酸和氨基酸代謝所需碳骨架的主要來源[44]。在幼根生長階段，需要合成大量的脂肪酸(用于合成生物膜)以及蛋白質。因此我們推測AOX途徑可以通過促進TCA循環提供更多的碳骨架以促進幼根的生長。

4 結論

高、低溫脅迫均會明顯減慢紫花苜蓿種子的發芽速率和幼根生長。在萌芽期和幼根生長期AOX和COX途徑都對種子萌發具有重要的作用，在種子萌發的初始階段，AOX途徑在高溫條件下的貢獻大，COX途徑在低溫條件下的貢獻大；在幼苗生長階段，不同溫度下AOX途徑對幼根生長的貢獻均大于COX途徑；此外，不同溫度對種子發芽的影響以及AOX和COX途徑對種子發芽的貢獻在2種紫花苜蓿間無明顯差異。