不同根系交互強度下紫花苜蓿/甜高粱體內氮營養動態特征研究

汪 雪， 劉曉靜， 趙雅姣， 王 靜

(甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070)

在間作作物的生長發育過程中，作物種間氮營養變化呈現出一種動態，不同的生長階段種間氮營養的互補利用和競爭程度不同。劉振洋等[9]在小麥/蠶豆(Viciafaba)的間作體系中發現，小麥和蠶豆對氮素的吸收呈單峰曲線變化，且兩者的高峰交錯出現，小麥的氮素吸收高峰在播種后80 d～92 d，蠶豆在67 d～77 d；劉英超等[10]在蠶豆/小麥的研究中發現，蠶豆對氮養分的吸收累積量在分枝期和籽粒膨大期時呈直線增加，在成熟期時增加量相對平緩；黨科等[11]在糜子(Panicummiliaceum)/綠豆(Vignaradiata)的間作體系中表明，間作糜子在開花期時的氮素含量比單作多了16.0%～41.7%，在成熟期時多了10.9%～15.9%。目前，關于種間氮營養的動態變化研究主要集中在小麥/蠶豆[10]、玉米/大豆[12]、玉米/甘薯(Dioscoreaesculenta)[13]等糧食作物的間作組合中，而對飼草作物種間營養元素的研究只定格在某個生長階段，且主要趨向于對磷[14]的研究，因此，開展間套作系統下牧草作物種間氮營養動態特征的研究具有重要意義。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為一種優質的豆科牧草，是畜牧乳業生產中不可或缺的重要植物性蛋白資源，其被廣泛種植，留床面積居世界第二位[15]。甜高粱(Sorghumdochna)含有豐富的脂肪、維生素、微量元素和糖類，既可收割做成青貯飼料也可調制成干草，具有良好的飼喂效果，是干旱、半干旱和高鹽堿地區畜牧業的優質飼草來源[16]。紫花苜蓿與甜高粱間作不但可以充分利用光能和養分，提高空間利用率，還可通過根系互利競爭促進氮素在農業系統中的利用，提高種群作物的產量和品質。而目前研究最多的是紫花苜蓿/玉米間作組合，且相關研究方向主要集中在地上部種間光能資源競爭利用[17]、生產潛力評定[18]和地下部土壤理化性質[19]等方面，而對紫花苜蓿/甜高梁間作組合的研究，尤其是根系互作下氮素的動態變化還未見報道。利用根系分隔法可真實有效地模擬間作中根系互作強度，更好地闡釋和控制種間氮營養吸收利用和轉移等過程。為此，本試驗以紫花苜蓿與甜高粱模擬間作為基礎，通過設置3個生育時期和3種不同根系分隔方式來研究其在不同生長階段下及不同種間互作強度的氮代謝特性和紫花苜蓿結瘤固氮特性，旨在揭示豆/禾間套作模式的種間互作下飼草作物氮營養動態變化，為減少氮肥施用量，促進豆/禾間作系統內養分資源高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫花苜蓿：采用的品種為‘LW6010’，由甘肅農業大學草業學院提供；甜高粱：采用的品種為‘海獅’，來自北京克勞沃公司。

1.2 試驗設計

本試驗于2018年在甘肅農業大學的防雨網室內進行。采用營養液砂培法來進行盆栽根系分隔試驗，紫花苜蓿與甜高粱栽植于裝有滅菌沙的塑料盆中(直徑為47 cm，高為40 cm)。試驗設置了5種種植模式，即：1)紫花苜蓿單作(MA)；2)紫花苜蓿與甜高粱間作根系不分隔(A-S)；3)紫花苜蓿與甜高粱間作根系尼龍網分隔[(尼龍網孔徑為0.2 mm) (NA-S) (部分分隔)]；4)紫花苜蓿與甜高粱間作根系塑料分隔[(PA-S) (完全分隔)]；5)甜高粱單作(MS)。每個處理重復3次。于2018年3月開始種植紫花苜蓿和甜高粱，后期間苗時紫花苜蓿單作每盆留20株、甜高粱單作每盆留8株，根系分隔種植的則將紫花苜蓿和甜高粱分別均勻地種植于盆兩側，其中紫花苜蓿留10株、甜高粱留4株。在未出苗前，每天用噴壺澆3次水保持濕潤，待作物出苗一周后，給每盆中加入2 L營養液，該試驗所用的N210(共210 mg N·L-1)營養液均使用Hoagland-Arnon營養液為基本營養液，營養液需每周澆一次，在澆之前需把上一次的用蒸餾水徹底淋洗干凈，然后再加入，并且需每周補充蒸餾水幾次使得液面保持在第一次加營養液的位置。該試驗分別于紫花苜蓿分枝期、紫花苜蓿現蕾期和紫花苜蓿初花期進行取樣，取樣時直接將裝有待測樣品的種植盆運至實驗室，然后快速從盆栽植株上進行莖葉的取樣測定氮代謝酶活性，后將根系用蒸餾水沖洗干凈，并用吸水紙吸干后迅速取樣進行根瘤數、根瘤重、固氮酶及氮代謝酶活性的測定。

1.3 測定指標

干物質重：取樣后先放置在105℃烘箱內殺青25 min，之后再將烘箱調至85℃烘36 h至恒重，冷卻后稱其重量。

單株根瘤數、單株根瘤重：地下部分取樣后，將根系用蒸餾水清洗干凈并用吸水紙吸干，然后迅速取出結節，每株紫花苜蓿所測得的根瘤數量為單株根瘤數、用天平測得的重量為單株根瘤重。

固氮酶活性：采用乙炔還原測定法[20]測定。

單株固氮潛力：為單株根瘤重與固氮酶活性的乘積。

NR,GS活性：參照鄒琦[21]的方法對植株葉片及根系進行測定，NR單位為μg·g-1·h-1，GS單位為μmol·g-1·h-1。

NiR活性：參照Rajasekhar[22]的方法對植株葉片及根系進行測定，單位為μg·g-1·h-1。

GOGAT活性：參考鄭朝峰等[23]的方法對植株葉片及根系進行測定，單位為μmol·L-1·min-1。

氮積累量：為干物質與氮含量的乘積，氮含量根據魯如坤[24]的凱氏定氮法測定。

1.4 數據分析

用Excel 2016軟件進行試驗數據的整理后，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，用最小顯著差異法(Duncan)檢驗各處理的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同根系交互強度下紫花苜蓿與甜高粱的干物質重

在3個時期下，紫花苜蓿地上干重均表現為4種種植方式之間無顯著性差異；紫花苜蓿地下干重在初花期時表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于不分隔和尼龍網分隔處理(P<0.05)，尼龍網分隔處理與塑料分隔處理之間無顯著性差異。甜高粱地上干重除分枝期外，均表現為不分隔處理顯著大于塑料分隔和甜高粱單作處理(P<0.05)；甜高粱地下干重在3個時期下，均表現為不分隔處理顯著大于甜高粱單作和塑料分隔處理(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同根系分隔方式對紫花苜蓿與甜高粱干重的影響Fig.1 Effects of different root partitions on dry weight of alfalfa and sorghum注：MA，A-S，NA-S，PA-S，MS，Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ表示紫花苜蓿單作處理、紫花苜蓿與甜高粱根系不分隔處理、紫花苜蓿與甜高粱根系尼龍網分隔處理、紫花苜蓿與甜高粱根系塑料分隔處理、甜高粱單作處理、紫花苜蓿分枝期、紫花苜蓿現蕾期和紫花苜蓿初花期；不同小寫字母表示不同根系分隔處理方式間差異顯著(P<0.05)。下同Note:MA,A-S,NA-S,PA-S,MS,Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ were monoculture alfalfa treatment,roots no barrier treatment of alfalfa and sweet sorghum,roots nylon mesh barrier treatment of alfalfa and sweet sorghum,roots plastic barrier treatment of alfalfa and sweet sorghum,monoculture sweet sorghum treatment,branching stage of alfalfa,budding stage of alfalfa and initial blooming stage of alfalfa respectively;Different lowercase letters indicate significant differences between different root separation methods at the 0.05 level. The same as below

2.2 不同根系交互強度下紫花苜蓿結瘤特性

2.2.1根瘤數、根瘤重 紫花苜蓿單株根瘤數在現蕾期時表現為不分隔處理顯著大于紫花苜蓿單作和塑料分隔處理(P<0.05)，在初花期時表現為不分隔和尼龍網分隔處理均顯著大于紫花苜蓿單作和塑料分隔處理(P<0.05)。在3個時期下，紫花苜蓿單株根瘤重均表現為不分隔處理顯著大于其它處理(P<0.05)，紫花苜蓿單作處理與塑料分隔處理之間無顯著性差異(表1)。

表1 不同根系分隔方式對紫花苜蓿根瘤數和根瘤重的影響Table 1 Effects of different root partitions on nodule number and nodule weight of alfalfa

2.2.2固氮酶活性、固氮潛力 紫花苜蓿固氮酶活性在分枝期時表現為不分隔處理顯著大于紫花苜蓿單作處理(P<0.05)，塑料分隔處理和尼龍網分隔處理之間無顯著性差異；在現蕾期和初花期時，均表現為不分隔處理顯著大于其它處理(P<0.05)。紫花苜蓿單株固氮潛力在3個時期下均表現為不分隔處理顯著大于其它處理(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同根系分隔方式對紫花苜蓿固氮酶活性和固氮潛力的影響Fig.2 Effects of different root partitions on nitrogrnase activity and nitrogen fixation capacity of alfalfa

2.3 不同根系交互強度下紫花苜蓿與甜高粱的氮代謝酶活性

2.3.1硝酸還原酶(NR) 在現蕾期時，紫花苜蓿地上NR活性表現為尼龍網分隔和塑料分隔處理均顯著大于紫花苜蓿單作和不分隔處理(P<0.05)，在初花期時表現為紫花苜蓿單作處理大于其它處理(P<0.05)；紫花苜蓿地下NR活性均表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于不分隔和尼龍網分隔處理(P<0.05)。甜高粱地上NR活性在分枝期和現蕾期時均表現為不分隔處理顯著大于塑料分隔處理(P<0.05)，在初花期時表現為不分隔處理顯著大于其它處理(P<0.05)；甜高粱地下NR活性除分枝期外，均表現為不分隔處理顯著大于尼龍網分隔和塑料分隔處理(P<0.05)(表2)。

表2 不同根系分隔方式對紫花苜蓿和甜高粱硝酸還原酶活性的影響Table 2 Effects of different root partitions on NR activity of alfalfa and sweet sorghum 單位：μg·g-1·h-1

2.3.2亞硝酸還原酶(NiR) 紫花苜蓿地上NiR活性除分枝期外，均表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于不分隔和尼龍網分隔處理(P<0.05)；紫花苜蓿地下NiR活性在3個時期下均表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于不分隔和尼龍網分隔處理(P<0.05)。甜高粱地上NiR活性除分枝期外，均表現為不分隔處理顯著大于甜高粱單作和塑料分隔處理(P<0.05)；甜高粱地下NiR活性除現蕾期外，均表現為不分隔處理顯著大于甜高粱單作和塑料分隔處理(P<0.05)(表3)。

表3 不同根系分隔方式對紫花苜蓿和甜高粱亞硝酸還原酶活性的影響Table 3 Effects of different root partitions on NiR activity of alfalfa and sorghum 單位：μg·g-1·h-1

2.3.3谷氨酰胺合成酶(GS) 紫花苜蓿地上、地下GS活性除分枝期外，均表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于其余3種分隔方式(P<0.05)，且均在初花期時表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于其它處理(P<0.05)。甜高粱地上GS活性在現蕾期和初花期時表現為不分隔處理顯著大于塑料分隔處理(P<0.05)；甜高粱地下GS活性在初花期時表現為不分隔處理顯著大于其它處理(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同根系分隔方式對紫花苜蓿和甜高粱谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig.3 Effectsof different root partitions on GS activity of alfalfa and sorghum

2.3.4谷氨酸合酶(GOGAT) 紫花苜蓿地上、地下GOGAT活性在初花期時，表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于其它處理(P<0.05)。甜高粱地上、地下GOGAT活性在初花期時，表現為不分隔處理顯著大于甜高粱單作處理(P<0.05)(表4)。

表4 不同根系分隔方式對紫花苜蓿和甜高粱谷氨酸合酶活性的影響Table 4 Effects of different root partitions on GOGAT activity of alfalfa and sorghum 單位：μmol·L-1·min-1

2.4 同根系交互強度下紫花苜蓿與甜高粱的氮積累量

紫花苜蓿地上氮積累量在分枝期時表現為紫花苜蓿單作和塑料分隔處理顯著大于尼龍網分隔(P<0.05)，紫花苜蓿單作處理與不分隔處理之間無顯著性差異；紫花苜蓿地下氮積累量除分枝期外，均表現為紫花苜蓿單作處理顯著大于不分隔和尼龍網分隔處理(P<0.05)。甜高粱地上氮積累量除分枝期外，均表現為不分隔和尼龍網分隔處理顯著大于甜高粱單作和塑料分隔處理(P<0.05)；甜高粱地下氮積累量在3個時期下，均表現為不分隔處理顯著大于甜高粱單作和塑料分隔處理(P<0.05)(表5)。

表5 不同根系分隔方式對紫花苜蓿和甜高粱氮積累量的影響Table 5 Effects of different root partitions on nitrogen accumulation activity of alfalfa and sorghum 單位：mg·plant-1

3 討論

在豆/禾間作系統中，由于豆科作物存在一種特殊的固氮方式，即其根瘤菌會將氣態氮轉化成有機氮并固定，繼而將由此產生的部分氮素向禾本科作物轉移來改善禾本科作物的氮營養狀況，進而使得豆科和禾本科作物種間存在氮營養互饋機制[5]。郝鳳研究發現，在不同的生長階段豆科作物結瘤固氮的程度是不同的，隨著生育期的推進豆科作物根瘤固氮的比例在逐漸上升，在初花期時根瘤氮可占31.1%[25]。在本研究中，紫花苜蓿的根瘤數、根瘤重、固氮酶活性和單株固氮潛力在各生長階段下均表現為不分隔>尼龍網分隔>塑料分隔和單作，即根系互作關系越緊密，其根瘤特性、固氮潛力等氮代謝能力越強。另外，隨著紫花苜蓿/甜高粱共生時間的推進，紫花苜蓿的根瘤數、根瘤重、固氮酶活性和單株固氮潛力在初花期時表現最佳，并表現為兩者根系互作緊密(不分隔)處理下顯著大于互作不緊密(塑料分隔)和紫花苜蓿單作處理，這可能是由于紫花苜蓿與甜高粱之間無任何的根系互作時，養分和水分都被塑料完全隔開，甜高粱無法競爭到紫花苜蓿根系周圍的氮素使得較高濃度的氮抑制了其根瘤的生長，李娟等[26]研究中也得出了相似的結論。而在紫花苜蓿與甜高粱根系緊密互作(不分隔)時，甜高粱會刺激根系的生長以獲取更多氮營養，以降低紫花苜蓿根系環境中的氮素濃度，從而有利于紫花苜蓿根瘤數目和有效性的增加，又因禾本科牧草甜高粱在間作系統中屬于優勢作物，豆科牧草紫花苜蓿結瘤固氮的提高加強了種間氮營養的互饋利用，進而提高了甜高粱氮素代謝及其物質積累，且隨著生育期的推進，紫花苜蓿與甜高粱的種間互作越來越強烈，并在紫花苜蓿初花期下的不分隔處理時表現最明顯。另有研究發現，當豆科與禾本科作物間作時，兩者產生的根系分泌物會發生化感促進作用，活化根際土壤中難溶性的磷和鐵，改變根瘤形態結構以及類菌體的超微結構[5]，且間作中種間強烈的氮素競爭會刺激根系分泌物中類黃酮物質組分和含量發生變化，最終促進根瘤的生長發育，提高其固氮能力，進而促進間作體系內氮素互饋及吸收和利用[27]。間作系統中豆科作物結瘤固氮能力的提高有利于群體作物產量和品質的提高[5]。在本研究中，紫花苜蓿的干重在3個生長階段下表現為紫花苜蓿單作下最高，可能是由于紫花苜蓿與甜高粱間作時，作為C4植物的甜高粱，其植株高大，在地上互作過程中擁有光熱資源的獲取優勢及高的光合效率，從而成為該體系內根系互作和地上互作的最大受益者，干重在3個生長階段下均表現為根系互作緊密處理下顯著大于互作不緊密處理，這與紫花苜蓿/甜高粱根系互作緊密時紫花苜蓿結瘤固氮能力提高的規律符合。

種間氮營養的吸收及利用與氮代謝關鍵酶活性密切相關，行距配置、品種和生育期的不同會使其表現不同，氮代謝關鍵酶活性的高低決定了作物對氮營養吸收、同化及利用的能力[28]。本研究發現，紫花苜蓿的NR，GS和GOGAT活性在不同生長階段下3種分隔方式表現不同。在各生長階段下紫花苜蓿NR，GS和GOGAT的活性表現為紫花苜蓿單作>塑料分隔>尼龍網分隔>不分隔，而甜高粱與此相反，即根系互作關系越緊密，紫花苜蓿的氮代謝能力越低，而甜高粱的氮代謝能力卻越強，在根系互作緊密(不分隔)時表現最佳，這是由于甜高粱與紫花苜蓿緊密互作時，促進了紫花苜蓿結瘤固氮并向甜高粱轉移，從而增強了種間氮營養的互補利用，種間豐富的氮營養提高了甜高粱氮代謝酶活性和氮代謝水平，促進了其生物量及氮素積累。并且，兩者均隨著共生時間的推進，3種根系互作下的NR，GS和GOGAT活性差距逐漸增大，在紫花苜蓿初花期時最明顯，此時，紫花苜蓿表現為根系互作關系越緊密，氮代謝酶活性越低，而甜高粱則相反，說明在不同生長階段，種間根系互作的強度是不一致的，且隨著共生期的延長，種間根系互作會越來越緊密，根系互作越緊密越有利于甜高粱對氮營養的競爭和利用，而對于紫花苜蓿而言，由于甜高粱對氮素的競爭，使得紫花苜蓿根系環境中的氮素濃度降低，刺激紫花苜蓿結瘤固氮和向甜高粱轉移，加強了種間氮營養的轉移利用，使得甜高粱NR，GS和GOGAT活性均有顯著的提高。唐秀梅等[29]對木薯與花生間作的根系相互作用研究中也有此發現。作物體內的氮素可在氮代謝酶的催化下轉化成有機氮及合成蛋白質，酶活性的高低對作物的產量及品質起著重要調節作用[30]，本研究中，紫花苜蓿和甜高粱的干重和氮積累量隨著生長的推進逐漸增加，在紫花苜蓿初花期時達到最大，且在該時期下，甜高粱均表現為根系互作越緊密，其干重和氮積累量越大，可見，適宜的根系互作和共生時間有利于甜高粱對氮營養的競爭和利用，從而提高氮代謝酶活性和氮代謝水平，最終增加甜高粱的生物量和氮積累量。

4 結論

本研究中，紫花苜蓿/甜高粱種間根系互作越緊密，越有利于刺激豆科牧草紫花苜蓿增加根瘤數和根瘤重，提高其固氮酶活性進行結瘤固氮，由此加強了紫花苜蓿/甜高粱種間氮營養的互饋利用，提高其中禾本科牧草甜高粱氮代謝酶活性和氮代謝水平，促進其生物量及氮素積累。

本研究還發現，紫花苜蓿/甜高粱在不同生長階段種間氮營養競爭和利用程度不同，在3種根系互作方式下，紫花苜蓿與甜高粱種間氮營養的競爭和互補利用均表現為隨著生長動態進程而增加。