KNO3和抗壞血酸對老化草地早熟禾種子活力的影響

錢文武， 黃志超， 朱慧森， 夏方山， 秦曉芳， 董寬虎

(山西農業大學草業學院， 山西 太谷 030801)

草地早熟禾是世界上應用最廣泛的冷季型草坪草之一，在我國主要分布在西北、華北、華中和西南等大部分地區，具有整齊均一、色澤優美、綠期長、耐踐踏、再生力強等特點，常運用于商品化生產草皮，有極高的觀賞價值和實用價值[16]。而草地早熟禾種子在其老化的過程中會出現脂質過氧化作用，該作用下產生的自由基會破壞細胞膜系統，從而導致種子活力下降，影響幼苗生長[17]，而引發處理能夠通過滲透調節提高種子萌發的速度和整齊度，提高苗的抗性和素質、改善營養狀況。因此，需要探索合理的引發處理來解決種子老化問題。本試驗選用KNO3和抗壞血酸作為引發劑，設置不同濃度和引發時間對自然老化的草地早熟禾種子進行處理，以期為緩解草地早熟禾老化種子篩選最優引發劑和引發時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草地早熟禾‘午夜’種子于2015年從北京正道公司購進，在山西農業大學草業學院種質資源庫中保存，種子相對含水量為5.64%。試驗于2020年進行，‘午夜’種子引發回干8 h后含水量為25.26%。

1.2 試驗設計

試驗選用KNO3、抗壞血酸和蒸餾水作為引發劑。KNO3濃度設為0%，1.0%，2.0%和4.0%，抗壞血酸濃度設為0，0.5，1.0和1.5 mmol·L-1；采用二因素完全隨機設計，以不進行引發處理的干種子為對照。對種子進行除雜篩選后，稱取2 g種子放入50 mL小燒杯中，分別添加6 mL的引發劑，封口后放在培養箱內引發1 d和2 d。引發結束后用紗布將種子濾出，蒸餾水沖洗，置于雙層濾紙的無蓋培養皿中回干1 d。將預先數好的100粒種子放置在鋪好濾紙的培養皿中，每個處理重復3次。培養箱條件設為：光照時間14 h·d-1、溫度25℃，黑暗時間10 h·d-1、溫度15℃，光照強度2 000 lx，相對濕度70%。

1.3 測定指標及方法

根據草種子檢驗規程—發芽試驗[18]，每天記錄發芽情況，直到第15 d試驗結束。在第15 d時取10株幼苗，用游標卡尺(精度為0.01 cm)測量根長和芽長，電子天平(精度為0.000 1 g)稱量苗鮮重。

計算公式如下：

發芽率=N15/M×100%

活力指數=∑Gt/Dt×(∑l1/10+∑l2/10)

平均發芽天數=∑Gt×Dt/∑Gt

芽長=∑l1/10

芽鮮重=m1/10

根長=∑l2/10

苗鮮重=m2/10

式中，N15為處理發芽前15 d的正常幼苗總數，M為種子總數(100)；Gt為第t天的發芽種子數(以胚根長為種子的1/2為標準判定發芽)，Dt為種子發芽t天；m1為總芽重，m2為總根重，l1為總芽長，l2為總根長。

1.4 數據統計處理

數據采用Excel 2003和SPSS 19.0統計分析軟件處理，Duncan’s法進行多重比較，結果以平均值±標準誤表示，Graphpad prism作圖。應用模糊數學中隸屬函數值法，對各處理后種子萌發和幼苗生長的相關指標進行綜合分析。公式如下：

指標性狀與引發處理效果正相關，公式為U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

指標性狀與引發處理效果負相關，公式為U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，U(Xi)是隸屬函數值；Xi是某處理水平某指標測定值；Xmax和Xmin為所有參試水平系中某指標中最大值和最小值。最后將每個處理各指標的隸屬函數值相加，求出平均值后進行排序。

2 結果與分析

2.1 不同引發處理對‘午夜’老化種子發芽率、平均發芽天數和活力指數的影響

由表1可知，除1.0% KNO3引發1 d，2.0% KNO3引發1 d和H2O引發2 d處理后的發芽率與對照(引發0 d)差異不顯著外，其他各處理的發芽率均顯著高于對照(P<0.05)，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發1 d處理后的發芽率在各處理中最高，比對照顯著提高37.36%(P<0.05)。KNO3和抗壞血酸引發處理可有效縮短‘午夜’老化種子的平均發芽天數，且在引發2 d時的平均發芽天數均顯著低于對照(P<0.05)。活力指數在各處理下，除H2O引發2 d略低于對照以外，其他均顯著高于對照(P<0.05)。隨著KNO3濃度的提高，種子的發芽率在引發1 d時呈先降后升趨勢，而在引發2 d時呈先升后降趨勢且在濃度為2.0%時達到各KNO3處理中的最大值，比對照提高32.30%，種子的平均發芽天數在引發2 d時呈先升后降的趨勢且均低于各梯度抗壞血酸處理后的平均發芽天數，其中4.0% KNO3處理后的平均發芽天數在各處理中最低，比對照顯著縮短2.01 d(P<0.05)；隨著抗壞血酸濃度的提高，發芽率隨著時間的延長呈升高趨勢，但在1.5 mmol·L-1時呈先升后降趨勢，而種子的平均發芽天數在引發1 d時呈先升后降趨勢，在引發2 d時呈升高趨勢，其中0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發2 d處理后的種子平均發芽天數比對照顯著降低15.09%(P<0.05)。引發1 d時，各引發處理后的活力指數差異均不顯著，引發2 d時，1.0%～4.0% KNO3處理后的活力指數比其在引發1 d時均有所提高且高于0.5～1.5 mmol·L-1抗壞血酸處理活力指數，但各處理間差異不顯著，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發1 d處理后的活力指數比對照提高65.43%，在各處理中達到最高。

表1 不同引發處理對‘午夜’老化種子發芽率、平均發芽天數和活力指數的影響Table 1 Influence of different priming treatments on germination percentage,mean germination time,and vigor index of aged seeds of ‘Midnight’

雙因素方差分析表明(表2)，不同引發時間處理下的發芽率差異相關(P<0.05)，平均發芽天數和活力指數差異均極顯著相關(P<0.01)；不同引發劑處理下的平均發芽天數差異極顯著相關(P<0.01)，發芽率和活力指數差異均不顯著。二者交互作用下的發芽率差異顯著相關(P<0.05)，平均發芽天數差異極顯著相關(P<0.01)，活力指數差異不顯著。

表2 時間和引發劑對發芽率、平均發芽天數和活力指數影響的雙因素方差分析Table 2 Variance analysis of time and initiator on germination percentage,mean germination time,and vigor index

2.2 不同引發處理對‘午夜’老化種子芽長和根長的影響

由圖1和圖2可知，除0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發1 d和1.0 mmol·L-1抗壞血酸引發2 d處理的芽長顯著低于對照(引發0 d)外(P<0.05)，其他處理相較于對照差異均不顯著，而根長在各引發處理中，除1.0 mmol·L-1抗壞血酸引發1 d與對照差異不顯著外，其他處理相較于對照均顯著提高(P<0.05)。隨著KNO3濃度的增加，芽長在引發1 d時呈現先升后降的趨勢，引發2 d時呈現先降后升的趨勢，根長整體呈現先上升后下降再上升的趨勢；隨著抗壞血酸濃度的增加，芽長和根長均呈現先下降后上升的趨勢。其中，1.0% KNO3引發1 d處理的種子芽長在所有處理中均最低，而根長比對照顯著增加61.16%。

圖1 不同引發處理對‘午夜’草地早熟禾老化種子芽長的影響Fig.1 Influence of different priming treatments on shoot length of aged seeds of ‘Midnight’ Kentucky bluegrass注：不同小寫字母表示同一時間在不同引發處理下對應各指標差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同種引發處理下不同時間對應各指標差異顯著(P<0.05)，下圖同Note:Different lowercase letters indicate the same time of different initiators are significantly different at the 0.05 level. Different capital letters mean the different time of the same initiators are significant different at the 0.05 level,the same as below

圖2 不同引發處理對‘午夜’草地早熟禾老化種子根長的影響Fig.2 Influence of different priming treatments on root length of aged seeds of ‘Midnight’

雙因素方差分析表明(表3)，不同引發時間處理下的芽長相關性不顯著，根長極顯著相關(P<0.01)；不同引發劑處理下的芽長和根長均顯著相關(P<0.05)。二者交互作用下的芽長相關性不顯著，根長顯著相關(P<0.05)。

表3 時間和引發劑對芽長和根長影響的雙因素方差分析Table 3 Variance analysis of time and initiator on shoot length and root length

2.3 不同引發處理對‘午夜’老化種子芽鮮重和根鮮重的影響

由圖3和圖4可知，除H2O引發2 d處理后的芽鮮重顯著高于對照(引發0 d)外，其他各處理的芽鮮重較對照差異均不顯著，而在各引發處理中，除1.0% KNO3引發1 d，1.0% KNO3引發2 d和4.0% KNO3引發2 d處理的根鮮重較對照差異不顯著外，其他均顯著高于對照(P<0.05)。隨著KNO3濃度的提高，芽鮮重在引發1 d時呈現先降后升的趨勢，引發2 d時呈現先降后升再降的趨勢；0.5 ～1.5 mmol·L-1抗壞血酸處理后的芽鮮重隨時間的增加呈現先降后升的趨勢。1.0%～4.0% KNO3處理后的根鮮重隨時間的增加呈現先升后降的趨勢；0.5 mmol·L-1抗壞血酸和1.5 mmol·L-1抗壞血酸處理后的根鮮重隨時間的增加呈現逐漸上升的趨勢，而在1 mmol·L-1時呈現先升后降的趨勢，其中，0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發2 d處理的根鮮重在所有處理中達到最大值，比對照顯著增加178%(P<0.05)。

圖3 不同引發處理對‘午夜’老化種子芽鮮重的影響Fig.3 Influence of different priming treatments on shoot fresh weight of aged seeds of ‘Midnight’ Kentucky bluegrass

圖4 不同引發處理對‘午夜’老化種子根鮮重的影響Fig.4 Influence of different priming treatments on root fresh weight of aged seeds of ‘Midnight’ Kentucky bluegrass

雙因素方差分析表明(表4)，不同引發時間和不同引發劑處理下的芽鮮重相關性不顯著，根鮮重均極顯著相關(P<0.01)。二者交互作用下的芽鮮重相關性不顯著，根鮮重極顯著相關(P<0.01)。

表4 時間和引發劑對芽鮮重和根鮮重影響的雙因素方差分析Table 4 Variance analysis of time and initiator on shoot fresh weight and root fresh weight

2.4 隸屬函數分析

采用模糊隸屬函數對所測的7個指標進行分析，綜合評價不同引發處理對‘午夜’老化種子萌發和幼苗生長的緩解能力，其中最優的3個組合依次是：0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發2 d，4.0% KNO3引發1 d，2.0% KNO3引發2 d(表5)。

表5 隸屬函數值及綜合評價Table 5 Subordinate function value and comprehensive evaluation

3 討論

種子老化會導致種子抗氧化酶活性下降，活性氧累積增多，脂質過氧化增強，細胞膜透性增大，膜完整性降低，最終導致活力下降[19]。前人研究表明，引發處理能夠緩解種子老化，促進種子萌發和幼苗的生長，這是由于引發劑中含有參與種子細胞內部物質轉換與合成的無機鹽離子和小分子物質，這些無機鹽離子和小分子物質作為植物生長調節劑和營養物質，在引發的過程中影響了種子萌發和幼苗生長的養分分配[20]。因此，通過引發劑處理可以達到修復種子的老化損傷，并達到顯著提高種子活力水平的效果[21]。

一定濃度的KNO3處理有利于緩解草地早熟禾種子老化，還有促進種子萌發和幼苗生長的作用，這是因為鉀可以激活種子脫氫酶活性和增加呼吸度，調節細胞溶液水勢延緩種子吸水過程，使種子在萌發前有足夠的時間進行膜系統修復和重要酶系的活化，改善細胞內環境和代謝狀態[22]，劉菲[23]對尾葉香茶菜(Rabdosiaexcisa)和藍萼香茶菜(Rabdosiajaponica)老化種子的研究時發現，尾葉香茶菜老化種子在0.5% KNO3引發0.5 d處理后，發芽率能達到40%以上，且藍萼香茶菜老化種子經1.5% KNO3引發1 d處理后，發芽率也能達到53%以上，這與本試驗結果相似。本試驗中，‘午夜’老化種子在各梯度的KNO3處理后的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數、根長和根鮮重較對照均有提高，且芽長和根鮮重受到抑制作用較小，說明1.0%，2.0%和4.0%的KNO3引發處理對‘午夜’種子的自然老化問題可以起到一定緩解作用。各梯度KNO3處理在引發2 d時種子的各項萌發指標均高于引發1 d的，這可能是隨著引發時間的延長，KNO3進一步促進誘導植物體內生長促進激素(如生長素和赤霉素等)的合成[24]，從而使草地早熟禾種子活力提高。

抗壞血酸作為一種小分子量的抗氧化物質，對防止細胞衰老具有重要作用[25]，前人通過對大豆(Glycinemax)[26]、甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)[27]和茄子(Solanummelongena)[10]等植物種子老化研究發現，抗壞血酸有提高種子內相關抗氧化酶的活性的作用，能夠有效清除活性氧代謝相關的物質。抗壞血酸除了具有清除自由基的功能以外，它還能促進植物細胞分裂，加快植物激素的合成，因此抗壞血酸在植物種子的萌發和幼苗的生長過程中發揮重要作用[28]。已有研究表明，抗壞血酸能顯著增加小麥幼苗和根的生長[29]。本試驗中，‘午夜’老化種子在各梯度抗壞血酸引發處理后，發芽率和活力指數明顯增加，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發1 d處理后的發芽率比對照提高37.36%，這與孫銘等[30]試驗結果相似。不僅如此，各梯度抗壞血酸處理后的根長均顯著高于對照(P<0.05)，但芽長比對照低，且1 mmol·L-1抗壞血酸引發2 d處理后的芽長顯著低于對照，這可能與植物不同器官正常生長所能夠耐受的滲透勢有關，植物的根部比芽能耐受更低的滲透勢[31]。

不同的引發時間對草地早熟禾老化種子的緩解效果也不同[32]，種子引發處理雖能提高水分脅迫下種子活力，但種子激發自身對外界萌發環境的協調能力有限，選擇有效的引發劑、引發方式和引發時間對種子的引發效果極其重要[33]。已有研究表明，不同的引發時間顯著影響紫花苜蓿(Medicagosativa)種子的活力指數，但對其最終萌發率影響不顯著，引發時間過長或過短都不利于水稻種子的萌發[34]。黃志超等[35]對草地早熟禾種子研究發現，引發處理能顯著提高種子的發芽率，在引發2 d處理后能達到64.93%，與對照差異顯著，這與本試驗結果相似。本試驗中，‘午夜’老化種子在不同引發時間處理下，發芽率和活力指數明顯增加，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發1 d處理后的活力指數比對照提高65.43%。因此，在引發的過程中要根據實際情況充分考慮引發劑和引發時間的選擇，從而實現通過引發處理緩解種子老化和提高種子活力的目的。

4 結論

本試驗通過綜合分析各引發處理對種子發芽率、活力指數、平均發芽天數、芽長、芽鮮重、根長和根鮮重等指標的影響發現，KNO3和抗壞血酸對草地早熟禾‘午夜’老化種子均有一定的緩解作用，其中2.0%～4.0% KNO3引發2 d對‘午夜’老化種子萌發和根生長產生顯著促進作用，但各引發處理對幼苗芽的生長提升效果均不明顯；通過模糊隸屬函數對所測定的7個指標分析得出：0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發2 d對‘午夜’老化種子萌發和幼苗生長的緩解效果最佳，其作用機制有待進一步研究。