圍產期奶牛脂肪肝生物標志物受試者工作特征曲線分析

盧立葉,牛富貴，王中華，林雪彥，王 云，侯秋玲

(山東農業大學動物科技學院，泰安 271000)

脂肪肝是圍產期奶牛高發的一種代謝紊亂疾病，尤其是高產奶牛。圍產期奶牛處于能量負平衡狀態導致體脂過量動員，造成肝臟甘油三酯(TG)堆積從而形成脂肪肝[1]。奶牛患脂肪肝使產奶量下降[2]，產犢間隔延長[3]，降低全身免疫力并且伴隨其他疾病發生[4]，如乳房炎、酮病、子宮內膜炎、胎衣不下、蹄病、皺胃變位等，對奶牛的生產繁殖能力、壽命以及經濟效益會產生巨大影響。因此，準確診斷脂肪肝既有利于奶牛健康又可以減少牧場經濟損失。

奶牛產前21 d至產后21 d為圍產期，此時奶牛面臨胎兒分娩、子宮修復、激素紊亂、抵抗力下降以及泌乳等生理和代謝的巨大改變[5-6]，因此,機體對能量、蛋白質、礦物質等營養物質的需求增加了數倍[7]。在此期間，奶牛采食量降低，通過飼糧攝入的營養物質不能滿足泌乳需求，從而導致嚴重的能量負平衡。飼糧提供的生糖前體物質不足使能量缺乏，最終導致血清葡萄糖(Glu)和胰島素(Ins)濃度降低，體脂發生動員，體內脂肪以非酯化脂肪酸(NEFA)的形式運輸到肝臟，直至在肝臟氧化產生能量。然而，隨著脂肪的分解，血漿中NEFA濃度升高。與奶牛患脂肪肝有關的因素眾多[8]，包括圍產期奶牛處于能量負平衡狀態、圍產期奶牛特殊的生理階段和代謝變化、肥胖程度、年齡、胎次、飼養管理和遺傳等方面的因素。

目前，脂肪肝的檢測方法有肝臟活檢[9]、血清生理生化[10]、蛋白質組學和代謝組學[11]、數字化圖像技術[12]等。在臨床上，通過血清生理生化診斷奶牛脂肪肝是比較容易實現的方法，目前比較認可的診斷方法為Reid提出的Y值法[13]，但是需要3項指標進行計算，不能直接判斷，所以不適合規模化牧場。因此，本研究初步篩選與脂肪肝有關血清指標作為生物標志物，用受試者工作特征(ROC)曲線評估生物標志物及診斷敏感性、特異性、準確性和最佳臨界值，以期為快速、準確診斷脂肪肝提供新依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 在山東泰安金蘭牧場、山東濟南高速牧場隨機選取77頭產后7 d中國荷斯坦奶牛，奶牛平均胎次為2.18胎，平均年齡為3.67歲。分娩后每天擠奶2次，早晚各飼喂1次全混合飼糧(TMR)，全天自由飲水。

1.1.2 樣品采集 晨飼前2 h尾根靜脈采集奶牛血液10 mL，放入促凝管內室溫靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，用移液槍吸出血清，分裝于1.5 mL離心管中，一式3份，-20 ℃保存。

1.1.3 主要試劑及儀器 谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、Glu、TG、總膽固醇(TCHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒均購自四川省邁克科技有限責任公司；NEFA ELISA試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；Ins、胰高血糖素(Gln)、載脂蛋白B(ApoB)、轉化生長因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒均購自南京奧青生物技術有限公司。全自動生化分析儀(7020)購自日立有限公司。

1.2 方法

1.2.1 奶牛分組 檢測采集的77頭奶牛血清中AST、Glu、NEFA的含量，根據公式Y=-0.51-0.003NEFA+2.84Glu-0.528AST 計算出Y值，將Y>1作為正常組奶牛，Y<1為脂肪肝組奶牛[13]。

1.2.2 血清生理生化指標檢測 用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、ALP、TP、ALB、Glu、TG、TCHO、HDL-C、LDL-C、NEFA、Ins、Gln、ApoB和TGF-β等的含量。

1.2.3 脂肪肝生物標志物篩選 用Spearman法分析血清ALT、AST、ALP、TP、ALB、Glu、TG、TCHO、HDL-C、LDL-C、NEFA、Ins、Gln、ApoB、TGF-β、FGF-21與Y值的相關性，將相關性和組間差異顯著的血清指標作為診斷脂肪肝的生物標志物。

1.2.4 ROC曲線評估 將生物標志物進行ROC曲線評估，曲線下面積(AUC)值>0.5[14]的指標具有診斷意義，經ROC曲線分析后獲得生物標志物診斷脂肪肝的敏感性與特異性，根據敏感性與特異性計算出約登指數(Youden)，不同的敏感性與特異性對應不同的約登指數，其中最大約登指數對應的即為生物標志物的最佳臨界值、敏感性與特異性。

1.2.5 生物標志物準確性驗證 用Reid方程計算的Y值診斷脂肪肝的準確率為100%做標準，利用實驗室前期檢測的461頭奶牛血清AST和NEFA數據，驗證本試驗結果得出的NEFA和AST最佳臨界值對脂肪肝診斷的準確率，NEFA診斷準確率(%)=NEFA臨界值檢出奶牛脂肪肝陽性數量/Y值檢出脂肪肝陽性數量×100%;AST診斷準確率(%)=AST臨界值檢出的奶牛脂肪肝陽性數量/Y值檢出脂肪肝陽性數量×100%;NEFA+AST診斷準確率(%)=NEFA、AST臨界值共同檢出的脂肪肝陽性數量/Y值檢出脂肪肝陽性數量×100%。

1.3 數據統計與分析

用SPSS 26.0統計軟件檢驗數據是否符合正態分布，結果用平均值±標準差表示，用非參數檢驗與獨立樣本t檢驗進行組間比較，用Spearman法進行相關性分析，用ROC曲線分析各檢測指標的診斷統計意義，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。 通過比較指標的ROC曲線下面積判斷指標診斷的準確性，根據Youden指數確定生物標志物的最佳臨界值，并計算敏感性、特異性及準確度。

2 結 果

2.1 奶牛生理生化指標檢測結果

采集分娩后7 d的77頭奶牛的血清，檢測NEFA、Glu、AST含量，Reid方程診斷結果表明，脂肪肝奶牛有11頭，正常奶牛有66頭。奶牛的常規生理生化指標檢測結果表明，NEFA、Glu、AST、ALT含量在兩組間差異極顯著(P<0.01)，TP含量在兩組間差異顯著(P<0.05)；血清中部分激素及細胞因子與載脂蛋白檢測結果表明，兩組間沒有顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同組奶牛血清生理生化指標檢測結果

續表

2.2 脂肪肝生物標志物篩選

通過Spearman法相關性分析可見，血清NEFA、Glu、AST、TP、TG、Gln與Y值之間存在極顯著相關(P<0.01)，NEFA、AST、ALT、Gln與Y值之間呈負相關(r=-0.63、r=-0.37、r=-0.28、r=-0.30)；Glu、TP、TG、LDL-C、Ins與Y值之間呈正相關(r=0.69、r=0.50、r=0.35、r=0.29、r=0.25)，結合表1中血清組間差異結果將NEFA、Glu、AST、ALT、TP、TG、LDL-C、Ins、Gln定為脂肪肝生物標志物(表2)。除血清NEFA、Glu、TP之外，其他指標相關系數絕對值都在0.50以下，相關性較低。

表2 血清指標與Y值間的相關性分析

2.3 ROC曲線評估生物標志物診斷性能

將生物標志物進行ROC曲線評估，以AUC值>0.50作為診斷標準，由表3可知，NEFA、AST、ALT和Gln的AUC值分別為0.91、0.75、0.75和0.56，可以用來準確診斷脂肪肝，診斷敏感性分別為81.8%、72.7%、63.6%和54.5%，診斷特異性分別為92.8%、89.4%、84.8%和69.7%，診斷最佳臨界值分別為471.74 μmol/L、95.50 U/L、46.50 U/L和64.60 ng/mL。其他相關因子AUC值均在0.50以下，不能準確診斷脂肪肝。NEFA的AUC值最高，說明診斷的準確性也最高，敏感性與特異性也高于AST、ALT和Gln。

表3 血清生物標志物ROC曲線診斷效能

2.4 NEFA和AST診斷性能驗證

461頭奶牛血清NEFA和AST的檢測結果表明，NEFA、AST和NEFA+AST的診斷準確率分別為89.96%、73.49%和69.08%(表4)。Y值診斷發病率為54.01%，NEFA、AST和NEFA+AST診斷發病率分別為48.59%、39.70%和37.31%。

表4 NEFA和AST最佳臨界值對脂肪肝的診斷準確率

3 討 論

Bobe等[15]研究表明,奶牛產犢天數與脂肪肝的發生密切相關，一般產后3～5 d開始發病，第2周發病較為嚴重，產后30 d內脂肪肝發病率達到35%～50%;也有研究表明,產后10 d奶牛脂肪肝發病率達到65%[16];Shen等[17]研究表明產后9 d奶牛脂肪肝發病率高達60.64%。本研究檢測461頭奶牛血清發現,產后7 d奶牛脂肪肝發病率高達54.01%，與以上研究結果相符。試驗所選牧場對產后7 d奶牛進行集中管理，為了方便采樣所以選擇產后7 d為采血時間。

本研究將Reid基于血清學提出的回歸公式作為診斷脂肪肝的方法，相較于其他方法，只需采集血清檢測所需指標，用公式計算即可判斷奶牛是否患脂肪肝。肝臟活檢是診斷脂肪肝的金標準，Reid公式診斷脂肪肝的準確率僅次于肝臟活檢，具有較高的診斷準確率，同時能夠避免對奶牛造成損傷，目前為多數研究人員所使用[18]。肝臟活檢會造成奶牛損傷，而Reid方程診斷脂肪肝需要多項指標進行公式計算，在臨床使用受到限制。在醫學領域，ROC曲線普遍用于疾病準確性診斷[19-20]，尤其是生物標志物診斷，所以本試驗用ROC曲線評估生物標志物最佳臨界值來直接診斷脂肪肝。

通過生理生化指標間差異與相關性分析可篩選出作為生物標志物的生理生化指標。從生理生化結果來看，脂肪肝奶牛產后干物質攝入量急劇下降，使奶牛處于能量負平衡狀態，導致NEFA濃度升高、Glu濃度降低。Glu是機體主要能量來源，奶牛開始泌乳后乳糖合成增多，乳腺對Glu的需求增加，為滿足營養需求，Glu被合理分配于各組織器官，導致脂肪肝奶牛血液Glu降低。 Du等[10]對產后3～9 d的15頭健康奶牛和輕度脂肪肝奶牛進行肝臟脂質代謝與線粒體適應研究表明，脂肪肝奶牛Glu低于正常奶牛，輕度脂肪肝奶牛的Glu為3.07 mmol/L,正常奶牛為3.75 mmol/L。 本研究中正常奶牛Glu含量為3.30 mmol/L，脂肪肝奶牛為2.67 mmol/L，脂肪肝奶牛Glu低于正常奶牛，與以上研究結果相符。AST、ALT主要通過肝臟產生，奶牛發生脂肪肝后，肝臟脂肪過度沉積、肝臟嚴重壞死或被破壞時造成AST、ALT升高。本研究中脂肪肝組TP低于正常組，說明脂肪肝奶牛體內能量低于正常奶牛，也進一步說明脂肪肝奶牛肝臟分泌TP的能力降低。

從相關性分析來看，血清NEFA、Glu、AST、ALT、TP、TG、LDL-C、Ins、Gln與Y值具有相關性，這些指標待進一步進行ROC分析。除NEFA、Glu、TP之外，其他生理生化指標與脂肪肝相關性普遍較低，可能是脂肪肝奶牛患病較輕，屬于輕度脂肪肝，與正常奶牛之間的數值差距較小。

本研究經過ROC分析確定NEFA、AST、ALT和Gln可作為脂肪肝診斷的生物標志物。Jorritsma等[21]研究表明，產后6～17 d脂肪肝奶牛的NEFA濃度顯著升高，可作為奶牛肝脂血癥的指標；Samanc等[22]研究發現，產后2 d奶牛會發生脂肪肝，認為產犢前后肝臟NEFA的酯化與TG的聚集隨著脂質動員增加[8]；當肝臟發生嚴重壞死或脂肪過度沉積時AST、ALT濃度升高[6,23]，表明AST、ALT可作為診斷奶牛脂肪肝的生物標志物；Sakowski等[24]研究表明，ALT的增加可能與產后奶牛能量負平衡引起的肝臟損傷有關。與ALT類似，AST濃度的增加表明圍產期奶牛代謝變化增強。Gln對脂肪肝診斷的準確性低于NEFA、AST和ALT，可能是由于激素變化反映圍產期奶牛全身代謝狀態，不只代表肝臟，但不排除Gln可作為診斷脂肪肝的生物標志物。總之，NEFA升高、Glu降低時奶牛處于能量負平衡狀態,AST、ALT升高是肝細胞以及線粒體發生破壞導致的，圍產期脂肪肝奶牛NEFA、AST、ALT和Gln發生顯著變化，說明其可以作為診斷圍產期脂肪肝的生物標志物。

在驗證部分，用NEFA、AST和NEFA+AST診斷脂肪肝的發病率均低于Y值診斷的結果，可能與Y值的診斷結果由3個生理生化指標共同得出有關，也有可能是本試驗采樣時間選自產后1周，奶牛未發展至重度脂肪肝，所以未在試驗中做脂肪肝分級有關。單獨用NEFA和AST最佳臨界值診斷時陽性檢出率高，而NEFA+AST的診斷準確率低于單獨使用，但也具有較高的診斷準確率，可見通過最佳臨界值可以更直接、快速、簡便地用于規模化牧場診斷脂肪肝。

4 結 論

經過ROC曲線評估后表明NEFA、AST、ALT、Gln能作為診斷圍產期奶牛脂肪肝的生物標志物。NEFA、AST、ALT、Gln作為生物標志物診斷脂肪肝具有明確的臨床最佳臨界值和較高的診斷敏感性與特異性，最佳臨界值分別為471.74 μmol/L、95.50 U/L、46.50 U/L和64.60 ng/mL。