紅嘴鷗TLR7基因克隆與生物信息學(xué)分析

常 華，段 綱，阮 謙，羅倩敏，余琬玲，劉清琦，黃翠琴，項(xiàng) 勛

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，昆明 650201；2.龍巖學(xué)院福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖 364012)

紅嘴鷗是分布于歐亞大陸和北美洲東部沿海的一種候鳥(niǎo)，每年冬天大量的紅嘴鷗從北方西伯利亞地區(qū)遷徙到中國(guó)南方越冬，其越冬地分布廣泛。從1985年秋季至今30余年在昆明翠湖從未間斷，且種群數(shù)量呈增加趨勢(shì)。野生鳥(niǎo)類(lèi)的遷徙與多種流行性疾病存在密切聯(lián)系，受到獸醫(yī)公共衛(wèi)生的關(guān)注，對(duì)于野生鳥(niǎo)類(lèi)機(jī)體的免疫機(jī)制研究尤為關(guān)鍵。對(duì)紅嘴鷗行為模式研究發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)越冬期間其以補(bǔ)充、積累能量為主；日間存在明顯的“上午覓食+中午休息+下午覓食”的行為模式，一天中最主要的行為是覓食。 而且它們熟悉昆明翠湖及周邊環(huán)境，在沒(méi)有人為傷害的情況下，對(duì)游客十分親近[1]。這些行為均極大地增加紅嘴鷗所攜帶病原體的傳播風(fēng)險(xiǎn)。2014年檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紅嘴鷗在遷徙過(guò)程中感染禽流感[2]；2020年檢測(cè)發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗可持續(xù)攜帶單增李斯特菌[3]。

天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原體入侵的首道防線(xiàn)，機(jī)體中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是能調(diào)控機(jī)體免疫的重要模式識(shí)別受體，在機(jī)體抗病原體感染中發(fā)揮重要的作用，該家族成員有TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR11、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9[4]。當(dāng)機(jī)體感染病毒后，TLR7可識(shí)別病毒的單鏈RNA，激活Ⅰ型干擾素IFN表達(dá)來(lái)啟動(dòng)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗病毒感染[5-6]。人感染流感病毒后TLR7/8介導(dǎo)的IFN-α蛋白分泌水平有明顯的上調(diào)作用[7]，豬肺泡巨噬細(xì)胞感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒后，TLR7顯著誘導(dǎo)β-干擾素(IFN-β)和γ-干擾素(IFN-γ)[8]。相較于人和其他哺乳動(dòng)物TLR7而言，禽類(lèi)TLR7研究主要集中在鴨、鵝、雞、鴿，鴨感染新城疫強(qiáng)毒后TLR7在骨髓和法氏囊內(nèi)表達(dá)上調(diào)[9]；鵝感染低致病性禽流感H9N2后TLR7在肺組織中相對(duì)表達(dá)量顯著升高[10]；在腎型傳染性支氣管炎病毒(NIBV)誘導(dǎo)的雞痛風(fēng)中，NIBV激活TLR4和TLR7信號(hào)通路并引起mRNA表達(dá)量的變化，促進(jìn)機(jī)體炎癥發(fā)生，引起腎臟損傷[11]。鴿感染新城疫病毒后TLR7與髓樣分化因子MyD88基因結(jié)合后激活干擾素調(diào)節(jié)因子信號(hào)通路，促進(jìn)α-干擾素(IFN-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素12(IL-12)等炎性因子的產(chǎn)生，從而介導(dǎo)免疫應(yīng)答[12]。相較于家禽TLR7基因功能研究，野生禽類(lèi)紅嘴鷗TLR7基因鮮見(jiàn)報(bào)道。 本研究用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)擴(kuò)增紅嘴鷗TLR7基因序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為后期深入研究TLR7蛋白抗病毒作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Tks GflexTMDNA Polymerase(R060A)PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker(3427A)、pMD19-T Vector(6013)、RNAiso Plus(9109)RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMⅣ 1st Strand cDNA Synthesis Mix(6215A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SMARTer RACE 5′/3′Kit(634858)、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；膠回收試劑盒(DP209)、小量質(zhì)粒提取試劑盒(DP103)、SYBR Premix ExTaqTM(FP205)熒光定量試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(5000Proll)購(gòu)自廣州博鷺騰生物科技有限公司；臺(tái)式離心機(jī)(Microfuge 20)和PCR儀(SimpliAmp Thermo Scientific)購(gòu)自伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 紅嘴鷗外周血淋巴細(xì)胞RNA提取 2019年10月在云南昆明翠湖采集3只紅嘴鷗血樣后分離淋巴細(xì)胞，在無(wú)菌EP管內(nèi)加入3 mL外周血和3 mL分離液，1 500 r/min離心20 min；吸取云霧狀層至無(wú)菌EP管并加入1 mL洗液，經(jīng)離心留沉淀，用2 mL RPMI 1640培養(yǎng)基吹打混勻，放在6孔板中培養(yǎng)，將培養(yǎng)8、12、24 h的淋巴細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下，用RNAiso Plus提取RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中雞(登錄號(hào)：FJ915562.1)、鴨(登錄號(hào)：MK986726.1)TLR7基因序列設(shè)計(jì)第1對(duì)引物F1和R1擴(kuò)增紅嘴鷗TLR7基因的部分片段；根據(jù)TLR7基因部分片段的測(cè)序序列設(shè)計(jì)第2對(duì)引物的上游引物F2，與RACE試劑盒中3′-RACE引物(作為下游引物R2)擴(kuò)增TLR7基因的3′-RACE片段；根據(jù)3′-RACE片段的測(cè)序序列和鴨(登錄號(hào)：MK986726.1)TLR7基因序列設(shè)計(jì)第3對(duì)引物(F3/R3)，擴(kuò)增TLR7基因的全序列,引物序列見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.3TLR7基因的克隆與測(cè)序 用 PrimeScriptTMⅣ 1st Strand cDNA Synthesis Mix 將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用引物F1/R1擴(kuò)增TLR7基因部分片段；用引物F2/R2擴(kuò)增TLR7基因3′-RACE片段；用引物F3/R3擴(kuò)增TLR7全基因。PCR擴(kuò)增體系25 μL：上、下游引物各1 μL，MgCl21.5 μL，dNTPs 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性50 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，經(jīng)過(guò)TA克隆至pMD19-T載體，連接體系為Solution Ⅰ 4 μL、pMD19-T載體1 μL，目的片段5 μL，放入16 ℃恒溫箱過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，并在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單克隆后，將其置于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證后，將陽(yáng)性菌落送至寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用DNAStar軟件中的MegAlign程序分析GenBank中原雞(登錄號(hào)：FJ915562.1)、紅腹角雉(登錄號(hào)：MK697329.1)、鵪鶉(登錄號(hào)：MK697327.1)、綠頭鴨(登錄號(hào)：XM_013108249.4)、黑天鵝(登錄號(hào)：XM_035542207.1)、山雀(登錄號(hào)：XM_033512663.1)、白鷺(登錄號(hào)：XM_009646337.2)、帝企鵝(登錄號(hào)：XM_009278529.2)、紅喉潛鳥(niǎo)(登錄號(hào)：XM_009813692.1)、巴布亞企鵝(登錄號(hào)：MN313017.1)與紅嘴鷗TLR7基因序列的相似性，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；采用ProtParam程序分析TLR7蛋白理化性質(zhì)；分別采用NetNGlyc1.0和NetPhos3.1程序預(yù)測(cè)蛋白糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)；分別采用ProtScale、SignalP v3.0和TMHMM Server 2.0程序分析蛋白的親/疏水性、信號(hào)肽切割位點(diǎn)和跨膜區(qū)；用在線(xiàn)軟件RARE CODON CALTOR(http:∥people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html)預(yù)測(cè)蛋白的稀有密碼子；采用PSORTⅡ Prediction在線(xiàn)軟件(https:∥psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位;利用SOPMA程序(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/)預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL在線(xiàn)軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 TLR7全基因克隆及序列分析

利用F1/R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物大小約300 bp(圖1A)，測(cè)序后比對(duì)，與預(yù)期相符，該片段為T(mén)LR7基因的部分片段。3′-RACE PCR擴(kuò)增條帶大小約700 bp(圖1B)，測(cè)序結(jié)果顯示成功獲得3′-RACE序列。F3/R3引物PCR擴(kuò)增條帶為1 720 bp (圖1C)，與預(yù)期一致。PCR產(chǎn)物回收后與pMD19-T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化挑菌鑒定發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)成功克隆了紅嘴鷗TLR7基因。測(cè)序結(jié)果表明，紅嘴鷗TLR7基因全序列長(zhǎng)度為1 720 bp。紅嘴鷗TLR7基因存在39個(gè)稀有密碼子，包括9個(gè)AGG、4個(gè)CGA、4個(gè)CGG、4個(gè)GGA、4個(gè)CUA、4個(gè)CCC、3個(gè)AGA、3個(gè)AUA、2個(gè)GGG、2個(gè)ACG，且含有8個(gè)連續(xù)的稀有密碼子CCCCGA、CGACUA、GGGAGG、AGGCUA。序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得GenBank登錄號(hào)為：MZ668652。

A，TLR7基因部分片段PCR擴(kuò)增;B，TLR7基因的3′-RACE序列擴(kuò)增;C，TLR7基因全序列PCR擴(kuò)增A，PCR amplification of partial sequence of TLR7 gene；B，PCR amplification of TLR7 gene by 3′-RACE；C，PCR amplification of full sequence of TLR7 gene圖1 紅嘴鷗TLR7基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of TLR7 gene in Larus ridibundus

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1TLR7基因相似性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 紅嘴鷗TLR7基因序列與GenBank中已公布的原雞、紅腹角雉、鵪鶉、綠頭鴨、黑天鵝、山雀、白鷺、帝企鵝、紅喉潛鳥(niǎo)和巴布亞企鵝的TLR7基因相似性分別為85.7%、84.9%、85.4%、87.0%、87.8%、86.8%、91.0%、93.1%、93.1%和93.1%(圖2)，其中與帝企鵝、紅喉潛鳥(niǎo)和巴布亞企鵝TLR7基因相似性都較高。利用DNAStar軟件分析并繪制進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗與鳥(niǎo)綱鷺科白鷺進(jìn)化關(guān)系較近，與家禽(原雞、鵪鶉、綠頭鴨)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

圖2 不同物種間TLR7基因核苷酸序列相似性比對(duì)Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of TLR7 gene in different species

圖3 TLR7基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of TLR7 gene

2.2.2TLR7基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì) 測(cè)序獲得的TLR7基因全序列長(zhǎng)度為1 720 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 182 bp，共編碼393個(gè)氨基酸，TLR7蛋白分子質(zhì)量約為63 ku。 分子式 C2080H3256N556O567S19，原子總數(shù)為6 478。蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為9.25。氨基酸組成中Leu含量(15.0%)最高，其次是Asn(7.4%)和Thr(6.4%)，His(2.0%)、Met(2.0%)和Trp(2.5%)含量均較少(表2)。

表2 紅嘴鷗TLR7氨基酸組成

2.2.3 TLR7蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽位點(diǎn)預(yù)測(cè) TLR7蛋白多肽鏈的預(yù)測(cè)值為0，推測(cè)TLR7蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)(圖4)。SignalP V3.0程序分析結(jié)果顯示，TLR7蛋白沒(méi)有信號(hào)肽切割位點(diǎn)(圖5)。

圖4 紅嘴鷗TLR7蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.4 Transmembrane prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

圖5 紅嘴鷗TLR7蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5 Signal peptide cleavage site prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

2.2.4 TLR7蛋白N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，TLR7蛋白含有6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第13、25、64、143、286、380位氨基酸處(圖6)。TLR7蛋白含有33個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中16個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)分別位于12、33、63、109、110、168、182、190、192、229、288、294、308、342、354、355位氨基酸處；4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)分別位于95、305、316、344位氨基酸處；13個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)分別位于27、57、83、145、176、193、201、203、254、297、302、314、382位氨基酸處(圖7)。

圖6 紅嘴鷗TLR7蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 N-glycosylation site prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

圖7 紅嘴鷗TLR7蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.7 Phosphorylation site prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

2.2.5 TLR7蛋白親疏水性分析 TLR7蛋白含有9個(gè)疏水區(qū)域，其最小值為-2.367，最大值為3.044。 疏水區(qū)主要集中在5-7、119-120、135-141、149-160、170-173、185-208、236-238、297-303和329-337位氨基酸處；親水區(qū)位于14-18、28-41、74-88、163-168、224-248、243-248、259-278、306-318、340-352、361-368和383-389位氨基酸處，該多肽鏈中親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，說(shuō)明該蛋白為親水性蛋白(圖8)。

圖8 紅嘴鷗TLR7蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.8 Hydrophilicity and hydrophobicity prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

2.2.6TLR7蛋白亞細(xì)胞定位 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，紅嘴鷗TLR7蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)(39.1%)、線(xiàn)粒體(17.4%)和細(xì)胞核(17.4%)中。

2.2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA程序預(yù)測(cè)紅嘴鷗TLR7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白中α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角分別占48.09%、32.06%、13.23%、6.62%(圖9)；使用SWISS-MODEL在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)紅嘴鷗TLR7蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，紅嘴鷗TLR7蛋白主要以α-螺旋為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，且與模型蛋白人TLR7蛋白相似性為68.78%(圖10)。

①h,α-螺旋;e,延伸鏈;t,β-轉(zhuǎn)角;c,無(wú)規(guī)則卷曲.②線(xiàn)條按照從長(zhǎng)到短的依次代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲①h,Alpha helix;e,Extended chain;t,Beta turn;c,Random coil.② The lines represent alpha helix,extended chain,beta turn and random coil,by the length,respectively圖9 紅嘴鷗TLR7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Secondary structure predicition of TLR7 protein in Larus ridibundus

圖10 紅嘴鷗TLR7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 Tertiary structure prediction of TLR7 protein in Larus ridibundus

3 討 論

紅嘴鷗在遷徙過(guò)程中會(huì)攜帶大量病原，其中不乏會(huì)有能導(dǎo)致人獸共患疾病的病原。為此，深入研究紅嘴鷗自身抗病毒的機(jī)制尤為關(guān)鍵。野生鳥(niǎo)類(lèi)基因序列與已報(bào)道的家禽基因雖有相似性，但保守區(qū)片段都非常短，此外紅嘴鷗是野生保護(hù)動(dòng)物，每次采血量不能過(guò)多，導(dǎo)致核酸獲得難度加大，試驗(yàn)設(shè)計(jì)引物時(shí)，要比對(duì)多個(gè)物種，尋找相似性非常高的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)同源序列引物，最終獲得紅嘴鷗TLR7基因的全序列，為后續(xù)基因分析奠定基礎(chǔ)。

大多數(shù)畜禽TLR7基因已有報(bào)道，且不同動(dòng)物TLR7基因長(zhǎng)度不同，如大鯢[13]TLR7基因全長(zhǎng)3 747 bp，ORF為3 150 bp(編碼1 049個(gè)氨基酸)；豬[8]TLR7基因全長(zhǎng)3 160 bp,ORF為3 153 bp(編碼1 050個(gè)氨基酸)；鴿[14]TLR7基因長(zhǎng)3 516 bp，ORF為3 175 bp(編碼1 047個(gè)氨基酸)；雞[15]TLR7基因長(zhǎng)6 747 bp，ORF為3 180 bp(編碼1 059個(gè)氨基酸)；鴨[16]TLR7基因全長(zhǎng)6 747 bp，ORF為3 270 bp(編碼1 089個(gè)氨基酸)。紅嘴鷗TLR7基因序列全長(zhǎng)1 720 bp，比雞、鴨TLR7基因片段都小。將紅嘴鷗TLR7基因與GenBank中已公布的10個(gè)物種TLR7基因進(jìn)行相似性分析，雖其與帝企鵝、紅喉潛鳥(niǎo)和巴布亞企鵝TLR7基因相似性都較高(93.1%)，但進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)紅嘴鷗TLR7基因與鳥(niǎo)綱鷺科白鷺屬白鷺進(jìn)化關(guān)系較近，與家禽(原雞、鵪鶉、綠頭鴨)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明該基因在不同物種間保守性存在差異。

家禽病毒感染機(jī)制研究中TLR7基因是非常重要的檢測(cè)基因，在體外感染試驗(yàn)中，感染禽流感病毒[17-18]、禽呼腸孤病毒[19]、禽冠狀病毒[20]、傳染性支氣管炎病毒[21]及傳染性法氏囊病毒[22]后均出現(xiàn)TLR7基因表達(dá)水平升高；鵝感染新型病毒性腸炎病毒(NGVEV)后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脾臟中TLR7基因mRNA高水平表達(dá),表明鵝TLR7在抗病毒防御中起重要作用[23]。TLR7基因在鴨先天免疫反應(yīng)中也起重要作用，poly(I:C)誘導(dǎo)刺激鴨胚成纖維細(xì)胞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鴨TLR7基因過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)β-干擾素(IFN-β)、干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT1、STAT2)的表達(dá)[16]。表明TLR7蛋白在病毒感染早期參與免疫反應(yīng)。本研究獲得了紅嘴鷗TLR7基因全長(zhǎng)，為后期研究TLR7蛋白的抗病毒活性奠定基礎(chǔ)。

紅嘴鷗TLR7基因存在3個(gè)以上相連的稀有密碼子，體外表達(dá)量低。在一定程度上蛋白表達(dá)量降低會(huì)影響蛋白純化效率，所以后期體外表達(dá)該蛋白時(shí)要考慮選擇利于表達(dá)的載體或表達(dá)宿主菌[24-25]。紅嘴鷗TLR7蛋白不是跨膜蛋白或分泌蛋白，后期體外表達(dá)該蛋白時(shí)要優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的溫度和表達(dá)的時(shí)間提高其表達(dá)量。紅嘴鷗TLR7蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，與鵝TLR7蛋白亞細(xì)胞定位[10]有相似之處。N-糖基化的位點(diǎn)突變可以加強(qiáng)或降低細(xì)胞及體液免疫。磷酸化修飾是可逆的，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)活動(dòng)等生理病理過(guò)程[25]。紅嘴鷗TLR7蛋白存在6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和33個(gè)磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)這些修飾可能與該蛋白的生理功能有關(guān)。后期TLR7蛋白功能研究可以借助修飾位點(diǎn)的變化來(lái)分析其抗病毒作用。這些蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果可為后期體外構(gòu)建紅嘴鷗TLR7基因原核表達(dá)載體及蛋白的表達(dá)優(yōu)化提供重要的科學(xué)數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得紅嘴鷗TLR7基因全序列，長(zhǎng)1 720 bp，ORF大小為1 182 bp，存在39個(gè)稀有密碼子，共編碼393個(gè)氨基酸，TLR7蛋白分子質(zhì)量約為63 ku。TLR7基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，紅嘴鷗與白鷺的親緣關(guān)系最近。TLR7蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)和信號(hào)肽切割位點(diǎn)，含有6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和33個(gè)磷酸化位點(diǎn)，是疏水性蛋白，主要存在細(xì)胞質(zhì)中。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。這些數(shù)據(jù)為后期探索紅嘴鷗TLR7蛋白參與抗病毒免疫機(jī)制的深入研究提供重要依據(jù)。