新型鵝星狀病毒一步法RT-PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

肖亦辰 楊穎 馬平 趙冬敏 章麗嬌 劉青濤 楊婧 李銀 劉宇卓 韓凱凱 黃欣梅

摘要：新型鵝星狀病毒（goose astrovirus，GoAstV）感染引起的鵝痛風(fēng)病，是近年嚴(yán)重危害我國養(yǎng)鵝業(yè)的傳染病之一，給我國養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，快速準(zhǔn)確診斷有助于更好地防控該病。為了建立一種鑒定新型GoAstV的一步法RT-PCR方法，根據(jù)新型GoAstV ORF2基因序列設(shè)計特異性引物，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并對引物用量和退火溫度等反應(yīng)體系和條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該方法能特異性擴(kuò)增新型GoAstV 512 bp基因片段，其他鵝常見病毒性病原擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，具有較高的特異性。敏感性試驗結(jié)果提示，最小檢測限量達(dá)4.54×102 拷貝/μL。此外，該方法重復(fù)性良好，應(yīng)用所建立的方法對新型GoAstV臨床樣品進(jìn)行檢測，102份鵝泄殖腔拭子的陽性率為46.08%，24份痛風(fēng)癥狀患病鵝內(nèi)臟樣本陽性率為91.70%。本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，且操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速，可用于新型GoAstV的臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞：新型鵝星狀病毒;一步法RT-PCR;鑒別診斷;鵝痛風(fēng)病;敏感性試驗;臨床樣品檢測

中圖分類號：S855.3 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0142-05

收稿日期：2021-05-06

基金項目：橫向課題“雛鵝痛風(fēng)病因確定和防控方法初探”。

作者簡介：肖亦辰（1998—），女，陜西西安人，碩士研究生，主要從事家禽疫病防控研究。E-mail：1457747114@qq.com。

通信作者：黃欣梅，博士，副研究員，主要從事家禽疫病防控研究。E-mail：hxmrene@126.com。

2016年以來，我國東部主要養(yǎng)鵝地區(qū)暴發(fā)一種以內(nèi)臟痛風(fēng)為主要特征的急性傳染病，給養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。該病主要影響21日齡以內(nèi)雛鵝，患病雛鵝表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、腹瀉、四肢癱瘓，剖檢可見心臟、肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官表面、胸腹膜及關(guān)節(jié)腔內(nèi)存在大量白色尿酸鹽沉積，死亡率為20%～50%。通過病原分離和動物回歸試驗，確定該病是由一種新型鵝星狀病毒（goose astrovirus，GoAstV）感染引起。基因序列分析結(jié)果表明，近年引起鵝痛風(fēng)的鵝星狀病毒毒株（GD、AHQJ18、SDPY、JSHA和SD01）與以往從雞、火雞、鴨和鵝等家禽體內(nèi)分離的禽星狀病毒的基因組同源性為49.5%～67.7%，編碼衣殼蛋白的ORF2基因核苷酸序列同源性僅為41.0%～59.0%，遺傳距離較遠(yuǎn)，形成獨(dú)立的進(jìn)化分支[3-7]。

目前，尚無有效疫苗和藥物預(yù)防或治療新型GoAstV引起的鵝痛風(fēng)病癥。因此，早發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確診斷是預(yù)防該病流行和傳播的重要手段。另外，含高蛋白的飼料引起的蛋白質(zhì)代謝障礙、藥物中毒引起的腎臟損傷也會導(dǎo)致血液中尿酸水平升高，引起鵝的痛風(fēng)，需要注意與新型GoAstV感染引起的痛風(fēng)鑒別診斷。經(jīng)典的病毒分離及血清學(xué)診斷方法雖準(zhǔn)確可靠，但存在費(fèi)時、費(fèi)力及對實(shí)驗室條件和生物安全性要求高等缺點(diǎn)，無法滿足臨床診斷的需要。目前，已有文獻(xiàn)報道檢測新型GoAstV的熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）方法[8-9]。盡管RT-PCR方法的靈敏度不如qRT-PCR，但RT-PCR方法擴(kuò)增的片段較長，經(jīng)測序后可用于基因型的確定和遺傳進(jìn)化分析，可廣泛用于新型GoAstV的檢測和流行病學(xué)調(diào)查。一步法RT-PCR檢測方法將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增反應(yīng)合并在一個反應(yīng)管中一步完成，減少中間環(huán)節(jié)引入污染源的風(fēng)險，不但節(jié)省時間，還可提高檢測準(zhǔn)確率。本研究根據(jù)新型GoAstV ORF2基因序列設(shè)計特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了準(zhǔn)確、靈敏、快速的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法，對新型GoAstV感染的快速診斷及有效防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞

新型鵝星狀病毒AHQJ18株、坦布蘇病毒JS804株（TMUV）、鵝細(xì)小病毒（GPV）、H9N2亞型禽流感病毒（H9 AIV）、鵝副黏病毒（GPMV）和雞肝癌細(xì)胞系（LMH）等由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ，購自寶生物工程（大連）有限公司;pEASY-T1載體，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA/RNA提取試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒、膠回收試劑盒等，購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司;一步法RT-PCR試劑盒、DNA Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參考GenBank已發(fā)表的新型GoAstV ORF2基因序列，應(yīng)用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計了1 對檢測引物，擴(kuò)增片段長度為512 bp，上游引物為PF：5′-TCCACCGAACACGCCACTA-3′，下游引物為PR：5′-AGCCGATTCCTGAGTTCCGTT-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

取200 μL新型GoAstV在LMH細(xì)胞上的培養(yǎng)物，采用RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，使用特異性引物PF和PR進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增新型GoAstV ORF2基因部分片段，回收純化PCR產(chǎn)物，克隆至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定。序列正確的陽性重組質(zhì)粒即為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，檢測質(zhì)粒濃度并計算質(zhì)粒拷貝數(shù)。

1.5 一步法RT-PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

1.5.1 引物濃度優(yōu)化 以新型GoAstV基因組RNA為模板，在0.2 mL PCR管中加入以下反應(yīng)組分：2×one step mix 12.5 μL，Enzyme mix 1.25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）設(shè)置5個梯度，各分別加入0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL和2.0 μL，模板RNA 2.0 μL，無RNase 雙蒸水加至總體積為25 μL，混勻，瞬時離心后置于PCR儀中。反應(yīng)程序為：50 ℃ 反轉(zhuǎn)錄 30 min;94 ℃ 預(yù)變性 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后，取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測。

1.5.2 退火溫度優(yōu)化 篩選出最佳引物使用量后，固定反應(yīng)體系及其他反應(yīng)條件，對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)置50、52、54、56、58、60 ℃ 6個梯度退火溫度，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)完成后，取10 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測。

1.6 特異性試驗

取新型GoAstV細(xì)胞培養(yǎng)物、TMUV、GPV、H9 AIV和GPMV，分別提取RNA或DNA，同時設(shè)置空白LMH細(xì)胞和生理鹽水為陰性對照，用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以評價該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

將測算好質(zhì)粒拷貝數(shù)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋，取4.54×108～4.54×100 拷貝/μL 9個濃度梯度作為模板，采用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以評價該檢測方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗

采用建立的一步法RT-PCR方法對4 份新型GoAstV陽性樣品及正常LMH細(xì)胞進(jìn)行3次重復(fù)檢測，以評估該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測

對2020年6—9月間江蘇常州金壇、沭陽地區(qū)102份16日齡左右揚(yáng)州白鵝泄殖腔拭子樣本，24份出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀患病鵝內(nèi)臟樣本，采用本研究建立的檢測方法檢測新型GoAstV核酸，以評估該方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

分別提取新型GoAstV細(xì)胞培養(yǎng)物和正常LMH細(xì)胞RNA，以本研究設(shè)計的引物進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測。由圖1可知，新型GoAstV細(xì)胞培養(yǎng)物在512 bp處可見單一的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期片段大小相符，而正常LMH細(xì)胞無擴(kuò)增條帶。回收PCR產(chǎn)物，連接至克隆載體pEASY-T1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定。由圖2可知，瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測顯示酶切片段為500 bp左右，與預(yù)期大小相符。測序結(jié)果顯示，所連片段與新型GoAstV AHQJ18株序列同源性為100%，表明新型GoAstV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建成功。采用核酸蛋白濃度檢測儀測定重組陽性質(zhì)粒濃度為221 ng/μL，計算得出其拷貝數(shù)為 4.54×1010拷貝/μL。

2.2 一步法RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 引物濃度優(yōu)化 固定其他反應(yīng)條件不變，對上、下游引物（濃度10 μmol/L）設(shè)置5個體積梯度，分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μL，進(jìn)行一步法 RT-PCR 擴(kuò)增。由圖3可知，當(dāng)上、下游引物（10 μmol/L）各加入體積為1.0 μL及以上時，即可獲得較高的擴(kuò)增效率，條帶無顯著差異，因此確定引物最佳體積為1.0 μL。

2.2.2 退火溫度優(yōu)化 固定一步法RT-PCR反應(yīng)體系，加入上、下游引物各為1.0 μL，在RT-PCR擴(kuò)增時設(shè)置6個退火溫度，分別是50、52、54、56、58、60 ℃，由圖4可知，退火溫度為54 ℃及以下時，目的條帶亮度均較強(qiáng)，差異不顯著，最終確定54 ℃為最佳退火溫度。

2.3 特異性試驗

利用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法對新型GoAstV細(xì)胞培養(yǎng)物、坦布蘇病毒（TMUV）、鵝細(xì)小病毒（GPV）、H9N2亞型禽流感病毒（H9 AIV）、鵝副黏病毒（GPMV），及空白LMH細(xì)胞和生理鹽水進(jìn)行檢測。由圖5可知，該方法僅對新型GoAstV可擴(kuò)增出長度為512 bp的目的基因，而對TMUV、GPV、H9 AIV、GPMV以及空白LMH細(xì)胞和生理鹽水的檢測結(jié)果均為陰性，表明本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法具有很好的特異性。

2.4 敏感性試驗

將新型GoAstV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從4.54×108 拷貝/μL開始做10倍倍比稀釋至4.54×100 拷貝/μL，取每個稀釋度樣品分別作為模板進(jìn)行一步法RT-PCR檢測。由圖6可知，該方法對新型GoAstV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最小檢出量為4.54×102 拷貝/μL，表明本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法具有

較高的敏感性。

2.5 重復(fù)性試驗

用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法對LMH正常細(xì)胞和4份新型GoAstV陽性樣品進(jìn)行3次重復(fù)性檢驗。由圖7可知，3次重復(fù)檢測均出現(xiàn)相同的結(jié)果，陽性樣品均能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，而LMH正常細(xì)胞未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，表明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測

采用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法對2020年6—9月間江蘇常州金壇、沭陽地區(qū)102份雛鵝泄殖腔拭子樣本和24份出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀患病鵝內(nèi)臟樣本進(jìn)行檢測（圖8）。檢測結(jié)果顯示，102份雛鵝泄殖腔拭子樣本中有47份為陽性，陽性率為46.08%;24份出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀患病鵝內(nèi)臟樣本中有22份為陽性，陽性率為91.70%。對新型GoAstV陽性樣品的擴(kuò)增條帶進(jìn)行序列測定，證實(shí)目的條帶均為新型GoAstV ORF2基因的特異性片段，表明本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR檢測方法可有效地對臨床樣品中的新型GoAstV進(jìn)行快速檢測，并具有良好的特異性和準(zhǔn)確性。

3 討論

2016年以來，由新型鵝星狀病毒引起的以內(nèi)臟痛風(fēng)為主要特征的傳染病在我國東部商品鵝養(yǎng)殖地區(qū)暴發(fā)，并迅速傳播至山東、江蘇、安徽、河北、遼寧、福建及廣東等省，給我國養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要發(fā)生于21日齡以內(nèi)雛鵝，患病雛鵝精神沉郁、采食量下降、腹瀉、四肢癱瘓，嚴(yán)重者死亡。剖檢可見肝臟、心臟、腎臟、胸腹膜以及翅、腿關(guān)節(jié)內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的白色尿酸鹽沉積。作為一種新發(fā)傳染病，目前還沒有商品化疫苗和藥物可用以預(yù)防或治療該病，為最大程度減少養(yǎng)殖業(yè)損失，早發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確診斷顯得尤為重要。

RT-PCR技術(shù)是一種比較成熟的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有快速、簡便、靈敏、特異性好和成本低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒及寄生蟲等病原檢測。且該方法可與基因測序相結(jié)合，用于進(jìn)一步的遺傳進(jìn)化分析。新型GoAstV為RNA病毒，檢測時需先將病毒基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在此過程中易增加污染風(fēng)險，造成假陽性。本研究建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法減少了操作和加樣步驟，降低了引入污染源的風(fēng)險，不但節(jié)省時間，還可提高檢測準(zhǔn)確率。

本研究根據(jù)新型GoAstV ORF2基因序列設(shè)計1對特異性引物進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，獲得的特異性片段克隆入pEASY-T1載體構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。為獲得最佳檢測效果，對反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定濃度為10 μmol/L的上、下游引物加入量為1.0 μL，最佳退火溫度為54 ℃。該方法僅對新型GoAstV可擴(kuò)增出特異性條帶，對其他鵝常見病毒性病原及正常LMH細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明該方法具有很好的特異性。新型GoAstV一步法RT-PCR方法的最小檢測限量為4.54×102 拷貝/μL，具有較高的敏感性，該方法同時還具有良好的重復(fù)性。應(yīng)用建立的新型GoAstV一步法RT-PCR方法對臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，102份鵝泄殖腔拭子的陽性率為46.08%，24份痛風(fēng)癥狀患病鵝內(nèi)臟樣本陽性率為91.70%。

因此，本研究建立的一步法RT-PCR方法可用于臨床鵝泄殖腔拭子和臟器樣本，及鵝胚和細(xì)胞培養(yǎng)物中新型GoAstV的檢測，靈敏度高，特異性強(qiáng)，并且快速準(zhǔn)確、操作簡便，可作為新型GoAstV臨床鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查的有力工具，為新型GoAstV感染的病原監(jiān)測和有效防控提供技術(shù)支撐。

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