江蘇省連云港市草莓根腐病病原菌的分離及鑒定

夏艷秋 鄭宇慧 嚴浩 張悅 陳靜 楊杰 朱強

摘要：草莓根腐病是影響草莓產業發展的主要障礙之一，其發病廣，危害重。本研究采用組織分離法，從連云港市東海縣黃川鎮草莓基地根腐病病害植株上分離草莓根腐病病原菌，采用rDNA-ITS序列分析方法結合病原菌形態學特征進行菌種鑒定。結果表明，共分離獲得5株典型病原真菌，包括4個種，分別是串珠鐮刀菌、棒孢擬盤多毛孢、膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌。果皮粗提物可以有效抑制草莓根腐病病菌。分離鑒定草莓根腐病病原菌，對分析草莓根腐病病原菌生物多樣性、創建病原菌快速檢測方法、深入研究草莓根腐病病害原因及綜合防治均具有理論價值及實踐意義。

關鍵詞：草莓;根腐病;病原菌;分離;鑒定

中圖分類號：S436.68+4 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）02-0085-06

收稿日期：2021-04-10

基金項目：江蘇省政策引導類計劃蘇北科技專項（編號：LYG-SZ201806）;連云港市“521工程”專項（編號：LYG52105-2018046）。

作者簡介：夏艷秋（1978—），女，江蘇徐州人，碩士，講師，從事生物發酵、生物防治等生物工程技術研究。E-mail：1121409728@qq.com。

通信作者：朱 強，碩士，高級實驗師，主要從事生物防治及果蔬生理等農業技術研究。E-mail：zq7685@163.com。

聯合國糧食及農業組織發布，2008—2018年，全球草莓產量增長了39.4%[1]。江蘇省是我國排名第4的優質草莓主產區，連云港市東海縣黃川鎮草莓基地被譽為“中國草莓第一鎮”，草莓種植多以小規模為主，采用簡單易行的連作栽培[2]。然而連作栽培易引起土傳病害也是不爭的事實，尤以草莓根腐病發病廣、危害重，且具有逐年上升趨勢，已成為草莓產業發展的主要障礙之一[3]。草莓根腐病由多種病原引起，各地區差異極大，連云港地區鮮有報道。欲保質增產，穩做“第一”，當務之急是弄清當地草莓根腐病病原菌種類及發病規律，并探尋綜合防治措施。筆者所在課題組長期從事草莓病害治理、高質繁育及加工等科研與實踐工作，取得一定成效，本研究主要對江蘇省連云港市草莓根腐病病原菌進行篩選、分離及鑒定，以期為明確草莓根腐病病害原因及生物防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

草莓病株樣本于2020年3月采集于江蘇省連云港市東海縣黃川鎮草莓基地，經鳳舞劍副教授鑒定為典型根腐病病株。

1.2 草莓根腐病病原菌的分離

取草莓根腐病病株，自來水沖洗2～3次，將初步清洗后的植株病害部位剪切成1 cm×2 cm小塊，用無菌鑷子夾取置于體積分數為70%的乙醇溶液中浸泡30 s后，用無菌水沖洗，然后置于0.1%的氯化汞中浸泡1 min，用無菌水沖洗，最后用無菌紗布拭去表面水分。用無菌組培刀將病害組織切成 0.5 cm×0.5 cm 組織塊，置于PDA培養基上28 ℃條件下培養2～5 d。挑取不同形態的菌株分離培養，多次純化培養后保藏備用[4]。

1.3 草莓根腐病病原菌的鑒定

1.3.1 形態學鑒定 （1）平板扦片法：將上述病原菌置于PDA培養基上28 ℃條件下培養，在菌絲生長初期，插入已滅菌的蓋玻片，待菌絲延伸至蓋玻片上，用乳酸、石炭酸、棉蘭染色，觀察菌絲生長及形態特征。（2）顯微鏡法：挑取菌絲，制作水浸片直接觀察。

1.3.2 分子生物學鑒定

采用r DNA-ITS序列分析法：即核糖體DNA內轉錄間隔區序列分析法，將上述病原菌純培養后提取DNA，進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳分離送至生工生物工程（上海）股份有限公司測定堿基序列。在NCBI網站GenBank數據庫中，采用BLAST軟件比對病原菌堿基序列與其他草莓根腐病病菌堿基序列的同源性，采用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹[5]。

1.4 果皮粗提物對草莓根腐病病原菌的抑制作用

采用牛津杯法測定果皮粗提物對草莓根腐病病菌的抑制作用。無菌條件下，將0.1 mL待測病原菌孢子懸液均勻涂布于PDA固體平板上，用鑷子在其上均勻放置3～4個牛津杯，杯中加入100 μL待測果皮提取物樣液，果皮提取物為火龍果果皮提取物、山竹果皮提取物、柚子果皮提取物、桔子果皮提取物、香蕉果皮提取物和石榴果皮提取物。28 ℃條件下培養2～5 d，觀察抑菌效果并測量抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 草莓根腐病病原菌的分離

采用組織分離法，從連云港市東海縣黃川鎮草莓基地根腐病害植株（圖1-A，圖1-B）上共分離得到4株細菌（圖1-C），11株真菌（圖1-D）。其中，有5株真菌表現出典型的草莓根腐病病害特征，分別命名為CMGF-1～CMGF-5。

2.2 草莓根腐病病原菌的鑒定

2.2.1 菌落形態學鑒定

從圖2可以看出，病原菌CMGF-1～CMGF-5中，有3株產色素，3株產菌核;5株初生菌絲均為白色，生長速度快（3～4 d即可鋪滿平板）;5株氣生菌絲發達，向空間延伸的能力強;其中，CMGF-4菌株生長速度最快，氣生菌絲為絨狀;3株菌落呈輻射環狀，2株菌落邊緣不規則。具體描述如下。

CMGF-1：菌落邊緣整齊，氣生菌絲發達呈白色，有黑色菌核形成，不產色素，菌落呈輻射環狀。

CMGF-2：菌落邊緣錯落，氣生菌絲發達呈白色，能產生菌核且分布廣，產黃色色素，邊緣菌絲黃色，內部菌絲白色，菌落無輻射環狀。

CMGF-3：菌落邊緣錯落，氣生菌絲發達呈白色，菌落邊緣形成黑色菌核，產黃色色素，內外菌絲均為黃色，菌落無輻射環狀。

CMGF-4：菌落邊緣整齊，發達的白色氣生菌絲形成絨毛狀，不產生菌核，產黑紫色色素，菌落呈輻射環狀。

CMGF-5：菌落邊緣整齊，氣生菌絲較為發達呈白色，不產菌核，不產色素，菌落呈輻射環狀。

2.2.2 微觀形態學鑒定

2.2.2.1 CMGF-1

從圖3可以看出，氣生菌絲無色無橫隔，孢子梗直而長，多以分生孢子座產孢，分生孢子呈短桿狀，兩端圓順，孢子無橫隔，脫落孢子盤為簇狀。

2.2.2.2 CMGF-2、CMGF-3

從圖4可以看出，CMGF-2、 CMGF-3氣生菌絲細長彎曲有橫隔， 分隔處收縮明顯，分生孢子呈紡錘形或船形，脫落孢子盤為葡萄狀，分生孢子頂端未觀察到附屬絲。2株菌微觀形態相似，結合“2.2.1”節菌落形態學特征，判斷為同屬，是否為同種還需進一步鑒定。

2.2.2.3 CMGF-4

從圖5可見，CMGF-4氣生菌絲筆直細長無橫隔，分生孢子初期為圓潤珠狀，以單梗方式產生孢子，分布于孢子絲兩側;后期展開為鐮刀狀，孢子展開后比釋放前直徑變短，孢子兩端鈍圓，多隔，可初步判斷為串珠鐮刀菌[6]。

2.2.2.4 CMGF-5

從圖6可以看出，CMGF-5微觀形態非常典型。氣生菌絲長而直且無橫隔，以單梗形式產生孢子，未釋放前，孢子為圓狀，釋放后為鐮刀狀;孢子細長且兩端尖銳，長度明顯大于釋放前圓形孢子直徑，可判斷為尖孢鐮刀菌[6]。

2.2.3 分子生物學鑒定

2.2.3.1 CMGF-1

從圖7可以看出，CMGF-1與KC010547.1 膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）在進化樹中距離最近，相似性為58%，可以判斷為同種，即CMGF-1為膠孢炭疽菌。

2.2.3.2 CMGF-2 從圖8可以看出，CMGF-2與KY_606543.1 棒孢新擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora）在進化樹中距離最近，相似性為87%，可以判斷為同種，即CMGF-2為棒孢擬盤多毛孢。

2.2.3.3 CMGF-3

從圖9可以看出，CMGF-3與KR_052094.1 棒孢新擬盤多毛孢菌（N. clavispora）在進化樹中距離最近，相似性為63%，可以判斷為同種，即CMGF-3為棒孢新擬盤多毛孢菌。圖8、圖9進一步印證了CMGF-2、CMGF-3的近緣性，可能為同種的2個亞種。

2.2.3.4 CMGF-4

從圖10可以看出，CMGF-4與NR_159818.1 串珠鐮刀菌（Fusariumcontinuum）在進化樹中距離最近，相似性91%，可以判斷為同種，即CMGF-4為串珠鐮刀菌，印證了“2.2.2”節中形態鑒定的結論。

3 結論與討論

本研究采用組織分離法，從江蘇省連云港市東海縣黃川鎮草莓基地根腐病病害植株中分離獲得5株草莓根腐病病原菌，根據形態學特征以及18S rDNA堿基序列，鑒定CMGF-1為膠孢炭疽菌或其亞種，CMGF-2、CMGF-3為棒孢擬盤多毛孢或其亞種，CMGF-4為串珠鐮刀菌或其亞種，CMGF-5為尖孢鐮刀菌或其亞種。草莓根腐病是由多種病原和環境互作引起的，連云港市特殊的海洋氣候及鹽堿生境，是否會改變病原菌的基因構型及致病毒力，基于r DNA-ITS序列分析的低相似同源關系是否與此有關，還有待于進一步深入研究。

草莓根腐病在我國各地均有發生。目前研究結果（表1）表明，草莓根腐病病原多達20種。從病害看，由絲核菌、鐮刀菌及擬盤多毛孢菌引起的草莓黑根腐病危害最重，影響最大，其病原涉及多個屬，甚至還包括線蟲類。其次為由膠孢炭疽菌引起的草莓紅中柱根腐病。從地域看，北方發病頻率更高，以北京市、河北省、山東省、吉林省及江蘇省等最為嚴重。病原差異主要表現為，北京市周邊病原種類較復雜，主要為絲核菌屬、鐮刀屬、多毛孢屬、炭疽屬及腐霉屬等;安徽省以尖孢鐮刀菌為主，浙江省以膠孢炭疽菌為主，河南省以鏈格孢菌為主。本次樣本分離自江蘇省，主要以鐮刀屬、多毛孢屬、炭疽屬為主。各地區草莓根腐病表征不同，相應的病原也不同，預防及治理方式亦要因病而異。

筆者所在課題組初步試驗結果表明，60%以上果皮粗提物均可以抑制草莓根腐病病菌。其中，火龍果果皮提取物的抑菌圈最大的達2 cm以上，表現出極強的抑菌效應（圖11），后期將重點研究果皮提取物在草莓病害方面的防治及應用。

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