淺析代謝組學(xué)臨床血清及血漿樣本的采集與前處理方法

邱偉華，熊琴平，何志梅，夏立，呂尚

（1.江西省疾病預(yù)防控制中心，南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330000）

代謝組學(xué)（Metabolomics）研究的主要內(nèi)容是生物體系新陳代謝動(dòng)態(tài)進(jìn)程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律以及應(yīng)激后（用藥、患病等）代謝產(chǎn)物隨時(shí)間變化的情況，以期最終闡明生物體系的代謝途徑并揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)[1]。代謝組學(xué)目前已經(jīng)成為了包括臨床診斷[2]、早期疾病監(jiān)測(cè)[3]、臨床不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)[4]、疾病生物標(biāo)志物鑒定[5]、藥物作用機(jī)制研究[6]等領(lǐng)域的首選研究手段之一，病理變化可以通過(guò)組織和生物體液樣本中代謝物的異常變化來(lái)表現(xiàn)，臨床代謝組學(xué)的一般研究過(guò)程見(jiàn)圖1。

而在臨床代謝組學(xué)中，血液樣本是最常用的研究材料之一，其中主要包括血清和血漿[7]，而血液樣本（尤其是大批量血液樣本）的復(fù)雜性和多樣性便成為了代謝組學(xué)，尤其是非靶向代謝組學(xué)的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。因此，血液樣本的質(zhì)量對(duì)于有效的診斷和適當(dāng)?shù)闹委煕Q定，以及可靠的、結(jié)論性的研究結(jié)果來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。大批量血液樣本的質(zhì)量往往取決于高重復(fù)性的收集和處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序（S tandard O perating P rocedures，SOP），一些血液樣本采集或處理過(guò)程中的不規(guī)范操作（如采血方式不準(zhǔn)確、樣本運(yùn)輸延遲、儲(chǔ)存溫度不適當(dāng)）會(huì)極大的影響血液樣本的質(zhì)量[8-11]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不規(guī)范、不準(zhǔn)確的血液樣本前處理將會(huì)造成60%～80%的臨床代謝組學(xué)測(cè)試誤差[12-15]，但通常來(lái)說(shuō)，人們往往會(huì)忽視血液樣本前處理方法，而把測(cè)試方法或儀器參數(shù)當(dāng)做誤差的主要來(lái)源。更加重要的是，在進(jìn)行代謝組學(xué)研究時(shí)，所使用的血液樣本類(lèi)型、采集方法和前處理方法應(yīng)保持一致，以此才能夠保證代謝組學(xué)分析的平行性和結(jié)果的科學(xué)性。

近年來(lái)基于代謝組學(xué)的血液樣本分析技術(shù)水平和應(yīng)用范圍有較大提高和拓展[16]，應(yīng)用包括研究人類(lèi)疾病以定義病理生理過(guò)程和發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物、研究藥物毒性和療效、研究環(huán)境與基因型的相互作用(如營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)，nutrigenomics)和脂質(zhì)研究(脂質(zhì)組學(xué)，lipidomics)[17]。但許多研究人員對(duì)樣本分析前的變量控制重視程度仍然不夠，這可能導(dǎo)致偶然誤差的增加，降低結(jié)果的可靠性和科學(xué)性，并且混淆最終的研究結(jié)果（如代謝輪廓模糊等）。因此，應(yīng)該制定詳細(xì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和規(guī)范血液樣本前處理SOP，并且嚴(yán)格執(zhí)行，以此確保能夠獲得可信的結(jié)果。本文對(duì)影響代謝組學(xué)研究的血液樣本分析前的變量進(jìn)行了系統(tǒng)討論。此外，本研究還提出了關(guān)于血液樣本選擇、采集程序、前處理程序和存儲(chǔ)條件的建議，以供相關(guān)研究和SOP制定參考。

圖1 臨床代謝組學(xué)一般研究過(guò)程

1 血液樣本的選擇

血清和血漿樣本均被廣泛應(yīng)用于靶向和非靶向代謝組學(xué)研究，兩者相似但不完全相同。血清是自然凝血過(guò)程后殘留的物質(zhì)，其中的血細(xì)胞以及參與凝血的蛋白質(zhì)已被清除；血漿是在用抗凝劑處理血液樣本以防止凝塊形成，通過(guò)離心除去細(xì)胞而得。這兩種從血液中去除細(xì)胞的方法將導(dǎo)致代謝組略有不同。就代謝輪廓來(lái)說(shuō)，兩者的代謝物種類(lèi)（峰數(shù)量）差異不大，而一些代謝物在兩者中的濃度（峰面積）差異較大。選擇血清或血漿開(kāi)展代謝組學(xué)研究，取決于研究的目標(biāo)代謝物類(lèi)型以及檢測(cè)方法，如：液相-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用 （gas Chromatography-Mass Spectrometry，GCMS）或核磁共振 （Nuclear Magnetic Resonance，NMR）。實(shí)際上，無(wú)論檢測(cè)方法是LC-MS還是GCMS，血清和血漿樣本在由主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）所得的得分圖上都有明顯不同[18-19]。Liu[20]等人以超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用（Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，UPLC-MS)為檢測(cè)手段，對(duì)不同的血清和血漿樣本進(jìn)行了代謝輪廓對(duì)比分析，在216個(gè)已鑒定的代謝物中，46%的代謝物水平存在顯著差異（P<0.05），只有3個(gè)代謝物（蛋氨酸、乙酰肉堿、丙酰肉堿）在血清中水平較低。顯然，血漿和血清的選擇必須基于實(shí)際考慮，然而，考慮到血漿和血清中可能存在的樣本組成差異，應(yīng)注意確保在任何特定研究中只使用一種樣本類(lèi)型。筆者總結(jié)了近3年以來(lái)血漿與血清在臨床代謝組學(xué)中的應(yīng)用實(shí)例（見(jiàn)表1）。

1血漿與血清在臨床代謝組學(xué)中近三年的應(yīng)用實(shí)例

2 血液樣本的采集

大批量、大規(guī)模代謝組學(xué)研究中最重要的一個(gè)部分就是正確的收集樣本集。臨床上采集血漿常用的抗凝劑有乙二胺四乙酸（EDTA）、枸櫞酸（檸檬酸）鹽以及肝素鹽等。其抗凝血機(jī)制分別為：（1）EDTA是通過(guò)與血液中的Ca2+形成配位化合物，從而抑制凝血活性；（2）枸櫞酸（檸檬酸）鹽是通過(guò)與血液中的Ca2+形成可溶性的螯合物，從而使Ca2+失去凝血作用；（3）肝素與血液中的抗凝血酶III結(jié)合后能增強(qiáng)其抗凝血活性，并且同時(shí)能降低絲氨酸蛋白酶的凝血活性，從而阻止血小板的聚集。相應(yīng)的，以上三種抗凝劑的一般選擇原則為：（1）枸櫞酸鹽是機(jī)體內(nèi)三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic Acid Cycle，TAC）的中間產(chǎn)物，以其作為血漿抗凝劑會(huì)對(duì)代謝組學(xué)的測(cè)定結(jié)果造成干擾，如果研究?jī)?nèi)容包括與TAC相關(guān)的代謝通路和靶點(diǎn)，一般不建議選擇枸櫞酸鹽作為抗凝劑[46]；（2）EDTA（鹽）應(yīng)用于NMR代謝譜時(shí)會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的噪音信號(hào)[47]，而應(yīng)用于LC-MS或GC-MS代謝組學(xué)分析時(shí)無(wú)此現(xiàn)象，因此在以MS作為代謝組學(xué)檢測(cè)平臺(tái)時(shí)，筆者建議以EDTA（鹽）作為血漿抗凝劑；（3）肝素是2種多糖交替連接形成的大分子多聚體，因此肝素鹽會(huì)在LC-MS代謝譜中產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾信號(hào)[48-49]，但由肝素鹽作為抗凝劑采集的血漿將含有更多的代謝物。就目前來(lái)說(shuō)，血漿代謝物研究應(yīng)采用何種抗凝劑依然沒(méi)有明確的規(guī)范和建議。因此在收集血漿樣本之前，研究者應(yīng)該綜合研究對(duì)象和檢測(cè)技術(shù)類(lèi)型對(duì)抗凝劑特點(diǎn)和局限性進(jìn)行全面考慮，使其能夠適用于整個(gè)研究過(guò)程，避免不必要的干擾。

血清樣本在臨床上的收集一般采用無(wú)添加劑（常規(guī)）和添加血清分離膠（快速）兩種方法。無(wú)添加劑采血時(shí)，全血經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間（30～60 min）自然凝固后析出血清；而添加血清分離膠（separate gel，高分子半固體疏水性膠體）與全血一同離心時(shí)，將形成三層：血清（上層）、血清分離膠（中層）及血細(xì)胞（下層）。如此，首先能夠有效的避免溶血以及凝血時(shí)間不一致對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的干擾，其次能夠大大縮短樣本收集時(shí)間，提高效率和樣本品質(zhì)。筆者將臨床所用的采血管（含凝血?jiǎng)┗虼倌齽┛偨Y(jié)歸納于表2。

3 血液樣本的前處理

表2 臨床采血管分類(lèi)及適用范圍

血清或血漿樣本的基質(zhì)比尿液等其它生物液體樣本更加復(fù)雜，尿液中的高分子量蛋白質(zhì)的濃度要低得多。制備用于LC-MS或GC-MS分析的血清和血漿樣本包括去除高分子量成分的步驟，一般為添加有機(jī)溶劑或混合溶劑沉淀這些成分，然后離心分離沉淀物和含有代謝產(chǎn)物的上清（去蛋白化）。甲醇（或根據(jù)需求添加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)制成內(nèi)標(biāo)甲醇溶液）與樣品的體積比為4∶1時(shí)，在室溫(15～20℃)下具有高效的蛋白質(zhì)去除效果[50]，且使用簡(jiǎn)單，取其上清液可直接進(jìn)行LC-MS分析；或取其上清液進(jìn)行衍生化后進(jìn)行GC-MS分析。常用的衍生化試劑有：MeOX （甲氧胺鹽酸鹽）[17，51]、MSTFA[N-甲基-N-（三甲基硅）三氟乙酰胺][17，52]、BSTFA[N，O-雙（三甲基硅）三氟乙酰胺][53]等。樣本與衍生化試劑的孵化時(shí)間、孵化溫度以及衍生化試劑加入量等條件將根據(jù)樣本和所用分析儀器的不同而有略微變化，用于非靶向代謝組學(xué)的孵化時(shí)間一般為各1.5小時(shí)，孵化溫度為60℃，衍生化試劑需加入過(guò)量[54-55]。

4 血液樣本的存儲(chǔ)條件

在制備血清和血漿后，應(yīng)將一定量的樣本快速冷凍于-80℃，直至分析。Gika[56]等人對(duì)比研究了在-20℃和-80℃條件下生物樣本中代謝物的變化程度：-20℃和-80℃存儲(chǔ)的樣本在6個(gè)月后代謝物的組成與0天時(shí)相比沒(méi)有顯著的變化。但Pottala[57]等人報(bào)道了部分脂質(zhì)組代謝物如DHA和EPA的濃度在-20℃下存儲(chǔ)3個(gè)月后會(huì)明顯降低。

樣本的穩(wěn)定性與每一種代謝物都相關(guān)，若將-80℃中的血液樣本直接置于室溫條件下，溫度的劇烈變化將會(huì)引起某些代謝物的變化。因此筆者建議血液樣本應(yīng)在-80℃存儲(chǔ)前分裝，避免反復(fù)凍融（不超過(guò)3次為宜，且需冰面操作），最佳情況是每個(gè)受試者收集多份血清或血漿樣本，并僅使用一次。

5 結(jié)語(yǔ)及展望

5.1 臨床血液樣本的采集和預(yù)處理的規(guī)范性亟待加強(qiáng) 血清和血漿是綜合性的生物液體樣本，人體中許多不同部位的功能和表型都融合其中，可以體現(xiàn)為組織代謝的“代謝足跡”[56，58]。然而，這種綜合性可以稀釋來(lái)自身體特定部位的微小代謝變化，在這些情況下，組織樣本可能更加適合代謝物發(fā)現(xiàn)(如：肝臟用于肝病的代謝組學(xué)研究)。血清和血漿含有成百上千的代謝物，據(jù)估計(jì)，人類(lèi)代謝組包含7800種代謝物，其中不包括許多與腸道微生物群、脂質(zhì)和藥物代謝相關(guān)的代謝物[59]，因此可以反映機(jī)體內(nèi)許多部位的代謝輪廓。

對(duì)于代謝組學(xué)檢測(cè)的樣本采集和處理方法，目前暫時(shí)沒(méi)有通用的指導(dǎo)性規(guī)范，因此筆者推薦采用以下血液樣本采集、預(yù)處理及存儲(chǔ)條件：選擇血清樣本或EDTA/肝素鋰抗凝血漿樣本；去蛋白化試劑:樣本體積比為甲醇∶樣本=4∶1；用于GC-MS非靶向代謝組學(xué)的孵化時(shí)間一般為各1.5小時(shí)，孵化溫度為60℃，衍生化試劑需加入過(guò)量；樣本應(yīng)當(dāng)提前分裝好，并置于-80℃冰箱存儲(chǔ)，盡量避免反復(fù)凍融（不超過(guò)3次），如需分析脂質(zhì)組代謝物，須在3個(gè)月之內(nèi)送檢。

5.2 應(yīng)根據(jù)臨床代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇采集血清或血漿樣本 筆者在總結(jié)了近3年以來(lái)血漿與血清在臨床代謝組學(xué)中的應(yīng)用實(shí)例后發(fā)現(xiàn)，由于血漿樣本較血清樣本具有更多的代謝物信息與更好的重復(fù)性[60]，因此常常用于研究與疾病（包括疾病的不同病程）相關(guān)的生物標(biāo)志物或代謝輪廓（代謝譜）；但由抗凝劑所引起的基質(zhì)干擾也可能掩蓋血漿中某些濃度較低的代謝物[61-62]，故在研究臨床用藥或飲食干預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物時(shí)，常常選擇整體靈敏度更高的血清樣本。因此，筆者建議在設(shè)計(jì)臨床代謝組學(xué)的實(shí)驗(yàn)方案之初，應(yīng)按照擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題和研究方向等實(shí)際情況，確定擬采集的臨床血樣種類(lèi)，以此保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。

5.3 人類(lèi)臨床血液樣本的代謝組學(xué)研究正從小規(guī)模向大規(guī)模拓展 人類(lèi)血液樣本的代謝組學(xué)研究通常有兩種不同的方式[17]：（1）小規(guī)模：在控制良好的實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn)環(huán)境中進(jìn)行，在此條件下，試驗(yàn)的隨機(jī)變量可控，并且相對(duì)極端（如：給藥、控制飲食等）。其優(yōu)勢(shì)是代謝組變化巨大，從而易于檢測(cè)和分析。此策略的樣本量可以很小，但結(jié)果仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）大規(guī)模：分析平臺(tái)、方法和技術(shù)的快速發(fā)展使研究從小規(guī)模控制擴(kuò)大到大規(guī)模，從短時(shí)間內(nèi)分析幾十例樣本的代謝組，擴(kuò)展到長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)分析數(shù)百、上千甚至幾千例樣本的代謝組。這種規(guī)模的擴(kuò)大需要在參與者對(duì)研究設(shè)計(jì)、樣本的收集和分析實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方面進(jìn)行詳細(xì)規(guī)劃，以便發(fā)現(xiàn)受試者隊(duì)列中的細(xì)微差異，使后續(xù)的數(shù)據(jù)分析無(wú)偏倚且符合目的和要求。大規(guī)模人類(lèi)臨床血液樣本代謝組學(xué)研究的特點(diǎn)是由不同個(gè)體間的生理機(jī)能、代謝狀態(tài)、生活習(xí)慣帶來(lái)的隨機(jī)變量多[63]且不易控制，這一特點(diǎn)對(duì)臨床樣本的采集和處理提出了更高的要求，也正是這一特點(diǎn)使得大規(guī)模人類(lèi)臨床血液樣本代謝組學(xué)研究的結(jié)果具有更高的普遍性意義和實(shí)際參考價(jià)值。