Xpert MTB/RIF技術在附睪結核快速診斷及利福平耐藥性分析與研究

賴海斌，周靜，陶俊，曾忠

（江西贛州市第五人民醫院結核科，贛州 341000）

結核病是結核分枝桿菌復合群（包括結核、牛、非洲和田鼠分枝桿菌）和麻風分枝桿菌感染人體引起的一種常見的傳染性疾病，臨床主要是根據患者不同的感染部位命名，如常分為肺結核、淋巴結結核、骨結核、泌尿系結核、肝結核等。在男性生殖系統疾病中附睪結核是一種常見的肺外結核，也是引起男性不育的重要病因，在泌尿生殖系統疾病中比較容易被誤診[1-2]。當前臨床鑒定MTB仍然以傳統羅氏固體培養及液體培養作為金標準，抗酸染色檢測廉價，但檢出率有限，同時MTB培養法所需時間長，檢測過程中易受污染，導致部分患者難以早期獲得相應治療[3-4]，熒光定量核酸擴增技術（Xpert MTB/RIF）檢測技術是臨床上較為常用而且快速的一種結核病診斷技術，常規用于結核病患者痰液、支氣管鏡肺泡灌洗液標本及其他結核病變部位標本檢測結核分枝桿菌及是否對利福平耐藥，在臨床應用中具有較高的敏感性、高特異性，生物安全性好、檢測時間短等優點。2010年WHO推薦在臨床Xpert MTB/RIF檢測技術可用于肺結核痰標本的檢測[5]，2013年WHO推薦Xpert MTB/RIF可以替代抗酸桿菌涂片、羅氏培養等技術用于結核分枝桿菌病的快速診斷。目前臨床上Xpert MTB/RIF檢測技術用于在附睪結核標本的檢測中尚無相關文獻報道，本文為進一步探析Xpert MTB/RIF技術用于附睪結核患者診斷及利福平耐藥性檢測中的臨床價值，收集80例患者入組觀察，具體報道如下。

1 資料及方法

1.1 基礎資料 納入本院2018年1月至2020年12月疑似附睪結核患者80例。疑似附睪結核患者入選標準：有肺結核病史、癥狀、體征，可觸及的附睪腫大；附睪穿刺所得膿液行病理學檢查提示結核可能；具有助于診斷的CT、MRI與B超檢查結果；附睪結核的確診標準：滿足以上疑似附睪結核性入選標準后加以下任何一點：附睪抽取標本涂片找TB陽性及標本行結核基因檢測陽性，結核病方案治療有效；附睪抽取標本行固體或液體培養陽性，同時菌種鑒定排除非結核分枝桿菌（NTM）。知情此次研究內容，自愿加入，且已同我院簽訂相關協議；精神正常，無老年癡呆、嚴重精神分裂、認知功能障礙。排除標準：有凝血功能異常、自身免疫相關性疾病；嚴重肝功能異常，心功能不全，呼吸衰竭，腎衰竭；查驗基礎資料有缺損。80例患者年齡19~65歲，平均（45.5±19.5）歲。本方案的研究方法及患者知情情況均已通過我院倫理委員會的審查討論并批準。

1.2 實驗材料及儀器試劑 穿刺采集腫大附睪膿液80份，傳統羅氏固體培養法（人工）以及羅氏培養管（珠海貝索生物技術有限公司），Xpert MTB/RIF檢測技術由美國Cepheid公司研發，以半巢式熒光定量PCR技術為基礎，可同時對臨床收集的標本進行結核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測，檢測儀器是全自動化，并且是一種全密閉檢測平臺。

1.3 方法

1.3.1 MTB培養及檢測 取膿液樣本1mL，使用40g/L的NaOH（氫氧化鈉）溶液處理樣本，接種于MTB培養基，于35℃環境中孵育，進行為期4周的連續觀察，見MTB培養斜面有MTB菌落生長則記為陽性，反之陰性。

1.3.2 Xpert MTB/RIF檢測Xpert MTB/RIF技術具體操作步驟如下：將臨床收集的標本進行冰凍處理，再根據Xpert MTB/RIF檢測流程，將冰凍標本沉淀物解凍，取1 mL標本液，同時在標本液中加入1.5 mL標本處理液，輕微混勻標本后放入室溫孵育15 min；依據儀器的檢測操作流程，取2 mL處理后的標本加入到一次性的標本盒中，然后將標本盒置入4通道GeneXpert平臺中自動運行。加入標本盒后約2 h，Xpert檢測系統可自動讀出結核分枝桿菌檢測結果與利福平耐藥結果。結果評估參照探針循環閾值（Cycle threshold，Ct)，內對照探針Ct值≤38即為陽性，反之無效，提示標本DNA提取含有PCR抑制物或不合格；5個探針中至少有2個探針Ct值≤35提示檢測結核分枝桿菌陽性，同時也可進行半定量測定。參考值分別是高含量：Ct值＜16，中等含量：16~22，低含量：23~28，極低含量：＞28。

1.3.3 藥敏試驗 借助比例法將分離菌株研磨制為2-10 mg/mL及4-10 mg/mL的混懸液，各取0.01 mL菌液置于利福平培養基、對照培養基，于37℃恒溫箱內進行為期4周的培養觀察。

1.4 觀察指標 記錄80例患者的臨床表現，以傳統羅氏固體培養法為參照計算Xpert MTB/RIF技術檢測符合率，最終以傳統羅氏固體培養的菌種分型及藥敏結果為參照標準，統計計算Xpert MTB/RIF檢測技術在MTB檢測及其利福平耐藥性的符合率、靈敏度、特異性。

1.5 統計學分析 使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，其中以[n（%）]作為疾病診斷的符合率、靈敏度等計數資料，最終完成χ2檢驗，P＜0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床表現情況

本次收集80例疑似附睪結核患者主要臨床表包括腫塊、消瘦、畏寒、盜汗、咳嗽、咯痰、憋氣等。見表1。

表1 80例疑似附睪結核臨床表現統計結果[n（%）]

2.2 利福平藥敏試驗結果 本次利福平藥敏實驗中培養法共計檢出MTB利福平耐藥18份（25.71%），敏感52份（74.29%），Xpert MTB/RIF技術檢測中檢出利福平耐藥17份（21.25%），敏感53份（75.71%），其中敏感樣本中1份樣本為假敏感。見表2所示，應用Xpert MTB/RIF技術檢測MTB利福平耐藥情況其符合率、靈敏度、特異度與培養法差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 兩種檢測方法利福平耐藥性檢測符合率、靈敏度、特異度比較

3 討論

泌尿生殖系統結核是因結核分枝桿菌感染引起的一種常見的難治感染性疾病，男性附睪結核出現附睪積液或附睪膿腫，在臨床診治過程中容易被誤診、誤治，延誤患者治療或就診泌尿外科行手術切除治療，最終導致不育或術后傷口潰爛無法愈合，嚴重影響患者生理及心理，加重經濟負擔，影響生活質量。附睪結核在疾病早期階段無明顯臨床癥狀，附睪無不適感，臨床上也無明顯的低熱、盜汗等結核全身中毒表現，且附睪結核的發病率通常較低，而且附睪結核病灶病變部位特殊，早期該病急性發作時，與附睪炎、精索發炎癥狀十分相似，附睪結核病理變化主要有干酪樣壞死、肉芽組織形成、纖維化、鈣化等[6]，這些病理演變復雜多變，或單獨存在，或同時存在，與急性細菌性附睪炎、慢性附睪炎急性發作、陰囊腫瘤性疾病合并感染等非結核性疾病不易鑒別，易造成漏診或延誤診斷，臨床上因此容易被忽視，大部分出現附睪體尾部不規則腫塊，腫塊逐漸蔓延至附睪頭體部、睪丸，甚至形成陰囊冷膿腫，繼而出現膿腫破潰、竇道形成。附睪結核的診斷及治療在臨床上面臨極大挑戰，疾病中晚期常出現切除附睪、睪丸的嚴重后果，較易誤診，因此對附睪結核的早期診治極為重要[7-8]。目前診斷結核病的主要方法包括抗酸染色鏡檢、MTB培養法、線性探診技術、基因芯片技術、Gene Xpert檢測系統等[9]，目前臨床常用的傳統檢測方法主要有抗酸桿菌涂片找TB、傳統羅氏固體培養，960液體培養、術后病變組織病理檢查等。臨床結核病診斷均以傳統羅氏固體培養結果作為該疾病的診斷標準，診斷結果準確率高，但是結核羅氏培養時間比較長，獲得陽性檢測結果最短需要2周時間，最長需要5周以上，而如果是陰性結果，則需要2月以上時間，耗時太長，延誤疾病治療，導致疾病進一步加重，導致患者難以接受[10]。臨床常用的抗酸桿菌涂片檢測率低，較難檢測出陽性結果，只有標本的結核分枝桿菌菌量濃度＞1000個/mL，才有可能出現TB陽性。目前臨床傳統羅氏固體培養法較單純抗酸涂片檢測有明顯優勢，標本中如果含有10~100個活菌，就能培養出TB陽性結果，也能行菌種鑒定及藥敏試驗，鑒別排除NTM，但唯一的缺點是耗時比較長，常需要6~8周時間[11]。附睪結核病屬于肺外結核，病灶處含氧量低，并不適合結核分枝桿菌生長，故含菌量較少，臨床常規檢測方法無法檢測，而固體培養、960液體培養法也不能有效的快速做出診斷，導致附睪結核患者不能明確診斷，得不到及時藥物治療，促使病變進一步發展惡化。

Xpert MTB/RIF檢測技術是一種基于realtime PCR的技術，臨床能快速檢測結核分枝桿菌，并且能檢測利福平耐藥基因突變，常規用于臨床肺結核的診斷和利福平耐藥的診斷[12-13]。Xpert MTB/RIF檢測主要是以半巢式熒光定量PCR為工作基礎，通過自動化儀器在全封閉檢測平臺完成檢測標本純化、標本細菌核酸的擴增、提取純化及濃縮等檢測流程。整個試驗流程都是在封閉的標本盒中完成。Xpert MTB/RIF技術針對結核桿菌rpoB基因81bp利福平耐藥核心區間設計引物、探針，檢測結核桿菌是否發生針對利福平突變，進一步明確是否為結核分枝桿菌以及是否對利福平耐藥做出臨床診斷，協助臨床制定有效的治療方案，而最終檢測時間僅需要2 h就可以獲得診斷結果[14]，為臨床醫生提供穩定、準確的檢測結果。既往傳統的檢測方式耗時較長，準確率低，Xpert MTB/RIF檢測技術能夠有效的彌補此方面檢測的缺陷。臨床上因為醫生制定治療方案的不規范，患者用藥的不規律性，菌種鑒定的不完善，導致繼發性耐藥結核的發病率不斷升高，因此在早期獲得結核分枝桿菌的藥敏試驗結果及菌種鑒定結果，有助于臨床醫生制定合理的抗結核治療方案，縮短治療療程。故在附睪結核疾病早期，如果有一種簡易而快速的檢測方法能夠提高其診斷陽性率，則能有效提高患者的治愈率，減輕患者經濟負擔，縮短治療療程，避免手術切除治療，改善附睪結核患者生活質量。

此次觀察中Xpert MTB/RIF技術用于MTB利福平耐藥性檢測中其符合率、靈敏度、特異度均達到95%以上，且與培養法比較差異無統計學意義（P＞0.05），表明Xpert MTB/RIF技術在MTB耐藥性檢測中與傳統培養法效能基本一致，黃建斌等人[15]的研究結果顯示，Gene Xpert Mtb/RIF檢測耐藥度為100.00%與傳統羅氏藥敏結果一致，且特異度為96.55%與傳統藥敏結果100.00%差異無統計學意義（P＞0.05）。本次研究結果、結論與該研究基本一致，可進一步證實Xpert MTB/RIF技術在附睪結核患者診斷及利福平耐藥性分析中的臨床應用價值。

綜上所述，證實了Xpert MTB/RIF技術在疑似附睪結核快速診斷中的臨床價值，也為附睪結核患者尋找一種敏感、快速且特異性高的新技術，降低本病的漏診或誤診率，在早期診斷、鑒別診斷及治療提供準確可靠的依據，避免因膿腫切除附睪等風險，其診斷效能及MTB利福平耐藥性分析的靈敏度、特異度與培養法一致，可積極在臨床推廣。