探討新發(fā)T1DM并DKA兒童免疫功能狀態(tài)分析

周斌，楊玉，劉志強(qiáng)，謝理玲，楊利，徐晗

（江西省兒童醫(yī)院，南昌醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院1.內(nèi)分泌遺傳代謝科；2.檢驗(yàn)科；3.兒內(nèi)科，南昌 330006；4.南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)部，南昌 330000）

兒童1型糖尿病 (Type 1Diabetes Mellitus，T1DM)是兒童期最常見的慢性疾病之一，其發(fā)病率有逐年增加趨勢，已成為全球最重要的公共衛(wèi)生問題之一。2021年國際糖尿病聯(lián)合會(huì)IDF發(fā)布了第十版《糖尿病地圖》顯示全球約有261萬年輕T1DM患者（<20歲），其數(shù)量為2015年的4倍[1]。T1DM是一種慢性免疫介導(dǎo)性疾病，是由于產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞遭到破壞引起胰島素缺乏而導(dǎo)致，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[2]。尤其是對(duì)于新發(fā)T1DM合并DKA患者的免疫狀態(tài)的臨床研究尚不多。因此，本研究通過觀察新診斷的T1DM合并DKA患者體液免疫、炎癥細(xì)胞因子及淋巴細(xì)胞亞群水平，探討其免疫功能狀態(tài)變化，為其進(jìn)一步的診療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年01月至2022年1月江西省兒童醫(yī)院收治的40例新發(fā)T1DM合并DKA患兒為觀察組，其中男16例，女24例，平均年齡8.9歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）指南及中國共識(shí)中的T1DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，并且排除器質(zhì)性疾病，如心臟、肝臟、腎臟及結(jié)締組織疾病者等情況。DKA的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2020年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)內(nèi)分泌遺傳代謝學(xué)組發(fā)布的最新的兒童DKA診療標(biāo)準(zhǔn)[4]：符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者，血酮體或尿酮體陽性，同時(shí)血?dú)夥治鯬H值＜7.3或者HCO3-＜15 mmol/L者納入觀察組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(SKJP220202151)，并得到所有受試者家屬知情同意。同時(shí)選擇同期來我院兒保科體檢的健康兒童20例作為對(duì)照組，其中男8例，女12例，平均年齡8.8歲。兩組兒童的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 觀察組與對(duì)照組兒童均抽取清晨空腹外周靜脈血5ml.(1)通過免疫比濁法使用全自動(dòng)生化分析儀檢測兩組兒童的外周血中的免疫球蛋白（IgM、IgE、IgA、IgG）的濃度。儀器及試劑使用FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司），TD5AWS離心機(jī)，美國賽默飛酶標(biāo)儀，洗板機(jī)（安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），恒溫孵育箱，PE anti-human TCRγδ（，Alexa Fluor488偶聯(lián)anti-human IL-17A McAb，PerCP anti-human CD3、CD8、CD4、CD16、CD56、CD19 McAb，Human IL-1B、IL2R、IL6、IL8、IL10、IL17、TNFα、IFN-γELISA Kit。留取靜脈血1ml放入普通管采集、離心并分離后得到血清，放-80℃冰箱保存后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-1B、IL2R、IL6、IL8、IL10、IL17、TNFα、IFN-γ的OD值，并根據(jù)試劑盒步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式后，將OD值轉(zhuǎn)化為的濃度值后匯總進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。使用淋巴細(xì)胞分離液從肝素抗凝的2 mL外周血標(biāo)本中提取單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)懸浮液后[5]，再使用胎牛血清培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106/mL，取其中細(xì)胞懸液加入豆蔻酰佛波醇乙酯、離子霉素及莫能菌素吹打混勻細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h。收集培養(yǎng)后細(xì)胞于流式上樣管中離心洗滌后再懸浮后待檢測。設(shè)立陰性對(duì)照并同時(shí)設(shè)立陽性對(duì)照組后，分別加入Per-CP anti-human CD19、CD3、CD8、CD4、CD16、CD56等淋巴細(xì)胞表面抗體并染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；最后得到原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入FACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)整理核對(duì)后采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用(±s)表示，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)符合正態(tài)性分布，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 觀察組體液免疫水平 觀察組IgA水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；觀察組IgE、IgG、IgM水平與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

表1 觀察組與對(duì)照組免疫球蛋白水平的比較（±s）

表1 觀察組與對(duì)照組免疫球蛋白水平的比較（±s）

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2.2 觀察組細(xì)胞因子水平 觀察組IL-1B、IL8、IFNγ水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，觀察組IL2R、IL6、IL10、IL17、TNFα水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 觀察組與對(duì)照組細(xì)胞因子水平的比較（±s）

表2 觀察組與對(duì)照組細(xì)胞因子水平的比較（±s）

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2.3 觀察組淋巴細(xì)胞亞群水平 觀察組B淋巴細(xì)胞數(shù)、B淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、NK細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中觀察組B淋巴細(xì)胞數(shù)、B淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為增高表現(xiàn)，NK細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為降低表現(xiàn)；觀察組的總T淋巴細(xì)胞數(shù)、總T淋巴細(xì)胞數(shù)百分?jǐn)?shù)、T4淋巴細(xì)胞數(shù)、T4淋巴細(xì)胞數(shù)百分?jǐn)?shù)、T8淋巴細(xì)胞數(shù)、T8淋巴細(xì)胞數(shù)百分?jǐn)?shù)及T4/T8與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 觀察組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群水平的比較（±s）

表3 觀察組與對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群水平的比較（±s）

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3 討論

傳統(tǒng)上，1型糖尿病（T1DM）被認(rèn)為是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。是由于分泌胰島素的胰腺β細(xì)胞損傷所致。有研究表明其損傷機(jī)制可能與其自反應(yīng)T細(xì)胞的直接相互作用有關(guān)。因此，大多數(shù)關(guān)于1型糖尿病（T1DM）免疫學(xué)的研究都集中在T細(xì)胞的功能上。這并不奇怪，因?yàn)樵诩膊『笃冢苑磻?yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)了產(chǎn)生胰腺β細(xì)胞的胰島素破壞[2]。但是，許多研究表明，如抗CD20（利妥昔單抗）療法通過廣泛消耗B細(xì)胞治療T1DM的成功，可以延緩非肥胖糖尿病（NOD）小鼠和新發(fā)患者的疾病進(jìn)展[6-7]。因此表明B細(xì)胞免疫耐受性的破壞也是T1DM的主要因素。

本研究結(jié)果顯示：兒童新發(fā)T1DM并DKA患者體內(nèi)B淋巴細(xì)胞水平及IgA水平顯著增高，提示此類患者體內(nèi)存在體液免疫的過度激活及功能紊亂。B細(xì)胞參與人類T1DM發(fā)展的具體機(jī)制尚未完全明了。有人認(rèn)為，與NOD一樣，B細(xì)胞通過抗原呈現(xiàn)促進(jìn)發(fā)病機(jī)制。HLA II類基因的DR3/4-DQ2/8等位基因?qū)1D疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)最大，表明抗原呈現(xiàn)給CD4 T細(xì)胞至關(guān)重要[8]。HLA I類等位基因在風(fēng)險(xiǎn)等位基因中排名第二。有趣的是，在新診斷的T1DM患者的胰腺淋巴細(xì)胞中，B細(xì)胞的頻率僅次于CD8 T細(xì)胞[9]。人們很容易猜測，這些B細(xì)胞是CD8 T細(xì)胞的主要抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presenting cells，APC），這在NOD小鼠中已經(jīng)證明了這一點(diǎn)。這些B細(xì)胞必須逃脫正常的沉默機(jī)制，并對(duì)抗原有反應(yīng)。這在與對(duì)照組相比，T1DM和SLE患者在λ+B細(xì)胞中的重組序列（RS）重組都減少了，表明這些自身免疫患者減少了受體編輯[10]。這些研究表明，自身免疫患者在開始RS重新排列時(shí)可能具有更高的自反應(yīng)閾值，可能允許更多的自反應(yīng)B細(xì)胞進(jìn)入外周。在這方面，最近研究表明，Ptpn22 T1D風(fēng)險(xiǎn)等位基因以B細(xì)胞的內(nèi)在方式發(fā)揮作用，允許自反應(yīng)B細(xì)胞進(jìn)入外周[11]。因此，間接證據(jù)表明，在人類T1DM胰島中，抗原反應(yīng)B細(xì)胞有可能逃脫耐受并進(jìn)入外周，通過向CD4和CD8 T細(xì)胞呈現(xiàn)抗原來促進(jìn)疾病的胰腺定位。

本研究結(jié)果顯示：兒童新發(fā)T1DM并DKA患者體內(nèi)IL-1B、IL8、IFN-γ水平顯著性增高，提示此類患者體內(nèi)存在炎癥相關(guān)因子水平的激活。在對(duì)一項(xiàng)134名新發(fā)的T1DM患兒的2年隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，與T1DM未緩解的患者相比，緩解者中的IL-8(P=0.042)濃度顯著升高。但也有研究表明，外周血的IL-8水平顯著升高與T1DM代謝控制不佳有關(guān)[12]。NOD小鼠作為T1DM的動(dòng)物模型，通過轉(zhuǎn)基因雜交技術(shù)，得到IL-17和/或IFN-γ雙缺陷的NOD小鼠，發(fā)現(xiàn)IL-17/IFN-γ受體雙缺陷NOD小鼠的長期糖尿病發(fā)病率明顯下降，但胰島自身炎癥沒有改變，這些結(jié)果表明IL-17/Th17參與了胰島炎的發(fā)展，并且IL-17和IFN-γ信號(hào)傳導(dǎo)可能協(xié)同促進(jìn)NOD小鼠糖尿病的發(fā)展[13]。已有多個(gè)研究顯示T1DM患者IL-1水平顯著增高，并有IL1受體拮抗劑的治療，如糖尿病行動(dòng) (AIDA)和TrialNet Canakinumab(TN-14)試驗(yàn)中的抗白介素-1治療或者卡那單抗的治療，盡管治療改善T1DM患者炎癥因子水平，但是并不能改善C肽釋放試驗(yàn)的C肽水平[14]。因此，T1DM存在細(xì)胞炎癥因子水平紊亂，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

NK細(xì)胞（natural killer cell，NK）是一種不表達(dá)T細(xì)胞（CD3)和B細(xì)胞（CD19）的大顆粒淋巴細(xì)胞，廣泛分布于外周各組織器官及血液循環(huán)系統(tǒng)，無須抗原的預(yù)先刺激與活化即可直接激活并通過分泌細(xì)胞因子及趨化因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，因此在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、抗感染及抗腫瘤等多方面有著不可或缺的作用[15]。雖然有研究在動(dòng)物模型和糖尿病患者發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞與T1DM的發(fā)病相關(guān)，但并無或益或損的定論。且在臨床T1DM患者中，外周血NK細(xì)胞活性和數(shù)量的變化研究也無最終的結(jié)論。臨床NK細(xì)胞研究未能深達(dá)胰腺的病理與其相互驗(yàn)證，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦未能完全模擬人體的病理狀態(tài)[16]。本研究顯示，T1DM合并DKA組的NK細(xì)胞數(shù)量及百分比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的減少。通過已有的數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)線索推導(dǎo)，T1DM患者外周血NK細(xì)胞的降低可能與NK細(xì)胞聚集在胰腺或淋巴結(jié)中的數(shù)量增加有關(guān)[17]。其次，動(dòng)物中的NK細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)研究中亦發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞可能下調(diào)IFN-γ分泌并同時(shí)下調(diào)自身反應(yīng)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，從而達(dá)到保護(hù)T1DM患者，減輕其自身免疫反應(yīng)[18，19]。這個(gè)機(jī)制恰好也可以解釋本研究NK細(xì)胞降低與IFN-γ增高這兩個(gè)結(jié)果的聯(lián)系。

T淋巴細(xì)胞的分化，根據(jù)CD4和CD8的表達(dá)，可以將其分為雙陰性（double-negative，DN）、雙陽性（double-positive，DP）和單陽性（single positive，SP）三個(gè)主要階段[20]。DN細(xì)胞通過“β-選擇”轉(zhuǎn)化為DP細(xì)胞，DP再通過陽性選擇（positive selection）分別與MHC I類分子結(jié)合則轉(zhuǎn)化為CD4-CD8+的單陽性T細(xì)胞，與MHCⅡ類分子結(jié)合則轉(zhuǎn)化為CD4+CD8-的單陽性T細(xì)胞。其意義在于使DP細(xì)胞分化為具有MHC限制性的SP細(xì)胞達(dá)到免疫作用保護(hù)機(jī)體。最后不能結(jié)合的SP細(xì)胞通過陰性選擇（negative selection）發(fā)育為成熟T細(xì)胞進(jìn)入外周免疫器官，清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，從而避免發(fā)生如T1DM類的自身免疫性疾病[21-22]。本研究為新發(fā)T1DM合并DKA患者，其存在T淋巴細(xì)胞分化的不暢，但T4淋巴細(xì)胞、T8淋巴細(xì)胞無顯著性改變，其CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)增高可能與T1DM處于早期階段有關(guān)，其后續(xù)變化仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，兒童新發(fā)T1DM合并DKA患者存在體液免疫功能異常，B細(xì)胞數(shù)量及IgA的增高，并且兒童新發(fā)T1DM并DKA患者體內(nèi)多種炎癥因子水平增高，存在CD4+CD8+雙陽性T淋巴細(xì)胞數(shù)增高及NK細(xì)胞的降低，提示兒童新發(fā)T1DM并DKA患者存在B淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞的雙重功能異常，淋巴細(xì)胞亞群功能紊亂可能為導(dǎo)致兒童T1DM的關(guān)鍵病因之一。