miR-761、TIMP-2 在老年高血壓非小細胞肺癌患者癌組織中的表達及預后相關分析

李珍珍

（河南省永城市人民醫院腫瘤科 永城 476600）

老年高血壓非小細胞肺癌（NSCLC）在肺癌中的發生率約占80%以上[1]。近年來醫療水平的發展使得NSCLC 的治療效果有很大的改進，但其5 年存活率仍未見明顯提高[2]。高血壓是老年肺癌患者常見合并癥，可增加患者治療難度[3]。微小RNA-761（microRNA-761，miR-761）在細胞穩態中發揮重要作用，可通過靶向調控線粒體融合和分裂維持細胞穩態[4]。基質金屬蛋白酶組織抑制因子-2（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2,TIMP-2）是蛋白酶活性的抑制因子[5]。Yan 等[6]研究中首次發現miR-761、TIMP-2 與NSCLC 有關，但其在高血壓NSCLC 預后中的作用和潛在機制尚不清楚。本研究旨在探討miR-761、TIMP-2 表達水平與高血壓 NSCLC 臨床病理特征及預后的關系。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 研究對象 以2015 年6 月至2016 年 7 月我院收治的89 例高血壓NSCLC 患者癌組織為高血壓肺癌組，其中男 47 例、女 42 例，年齡 60~87 歲、平均（71.57±10.33）歲。取其癌旁組織作為癌旁對照組。同期選取87 例單純NSCLC 患者的癌組織作為肺癌組，其中男 46 例、女 41 例，年齡 60~87 歲、平均（72.42±10.26）歲，與高血壓肺癌組一般資料比較無顯著性差異（P＞0.05）。納入標準：NSCLC 符合診療規范[7]，并經病理學證實；按照醫囑正規治療；知情同意書；無治療史；首次確診。排除標準：合并感染者；失訪者；臨床資料不完整者；繼發性NSCLC 者；腦血管疾病者。本研究經醫院倫理委員會批準（編號：2014-07-158）。

1.2 研究方法

1.2.1 癌組織miR-761 表達水平測定 采用RNA提取試劑盒（貨號：JL1545，QIAGEN 公司）從癌組織中抽提總RNA，反轉錄試劑盒（貨號：FSQ-301，上海研卉生物公司）得到cDNA，然后利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（貨號：DRR041A，Takara 公司）配制反應體系，在CFX384 定量分析上擴增miR-761 及其內參U6。引物由上海生工生物公司設計并合成，見表1。采用 2-△△Ct法計算 miR-761 相對表達量。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.2 癌組織TIMP-2 蛋白表達的測定 取新鮮組織，10%甲醛固定標本后，對組織標本進行切片，采用免疫組織化學法檢測組織TIMP-2 蛋白表達水平，按照SP 試劑盒（貨號：CDLG-4851，武漢純度生物公司）說明書操作，用PBS 代替一抗作為陰性對照，TIMP-2 抗體（貨號：ATA38720，武漢益普生物公司）。以胞漿內出現棕黃色或棕褐色定義為陽性細胞。兩種計分乘積：≤2 分為低表達，≥2 分為高表達。見表2。

表2 計分標準（分）

1.3 隨訪 高血壓NSCLC 患者術后以電話或門診方式隨訪5 年，生存期從手術之日起計算，截至2021 年 7 月。

1.4 統計學分析 采用SPSS22.0 處理數據，計量資料用（）表示，行t檢驗；計數資料用%表示，行χ2檢驗；Kaplan-Meier 分析 miR-761、TIMP-2 水平與預后的關系；多因素COX 回歸分析高血壓NSCLC 預后的影響因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組miR-761、TIMP-2 表達水平比較 高血壓肺癌組miR-761 表達水平分別高于肺癌組、癌旁對照組 （t=8.386、19.557，P=0.000、0.000），肺癌組miR-761 表達水平高于癌旁對照組（t=17.090，P=0.000）。高血壓肺癌組與肺癌組TIMP-2 高表達率比較，差異無統計學意義（χ2=1.835，P=0.176），癌旁對照組TIMP-2 高表達率分別高于肺癌組、高血壓肺癌組（χ2=5.798、14.052，P=0.016、0.000）。見表 3、圖 1。

表3 三組 miR-761、TIMP-2 表達水平比較（）

表3 三組 miR-761、TIMP-2 表達水平比較（）

注：與癌旁對照組比較，*P＜0.05；與肺癌組比較，#P＜0.05。

組別 n miR-761 TIMP-2[例（%）]癌旁對照組肺癌組高血壓肺癌組89 87 89 1.02±0.27 1.81±0.34*2.46±0.64*#56（62.92）39（44.83）*31（34.83）*

圖1 高血壓肺癌組（左）、肺癌組（中）與癌旁對照組（右）中TIMP-2蛋白表達（×400）

2.2 癌組織miR-761、TIMP-2 表達與臨床病理特征的關系 以miR-761 表達水平平均值（2.46）為界，將患者分為miR-761 高表達組45 例，miR-761低表達組44 例。miR-761 高表達組、TIMP-2 低表達組腫瘤≥3.0 cm、有淋巴結轉移、組織低分化、TNMⅢ-Ⅳ期患者比例高于miR-761 低表達組、TIMP-2高表達組（P＜0.05）。見表4。

表4 癌組織miR-761、TIMP-2 表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 癌組織miR-761、TIMP-2 表達水平與高血壓NSCLC 預后的關系 miR-761 高表達者5 年生存率（31.11%） 低于 miR-761 低表達者（59.09%）（χ2=7.039，P＜0.05）。 TIMP-2 高 表 達 者 5 年 生 存 率（64.52%）高于TIMP-2 低表達者（34.48%）（χ2=7.364，P＜0.05）。見圖 2 至圖 3。

圖2 癌組織miR-761 表達水平與預后的關系

圖3 癌組織TIMP-2 表達水平與預后的關系

2.4 高血壓NSCLC 預后的影響因素分析 以組織分化程度、腫瘤大小、miR-761、TNM 分期、淋巴結轉移、TIMP-2 為自變量，將是否死亡作為因變量，COX回歸顯示，miR-761、TIMP-2 是高血壓 NSCLC 患者預后的影響因素（P＜0.05）。見表5。

表5 高血壓NSCLC 預后的影響因素分析

3 討論

NSCLC 是肺癌最常見的組織類型，其發病率和死亡率逐年上升[8]。大多數NSCLC 患者早期癥狀不典型，多數患者就診時已屬晚期，且老年患者常合并高血壓等并發癥，使其治療較為困難，造成患者生存率很低[9]。目前隨著研究的進一步深入，miRNA 或某些特定基因的檢測有利于精確地預測肺癌患者的預后[10]。因此，探究高血壓NSCLC 發病相關因子及其分子生物學特點對疾病的診治可能有重要意義。

研究表明，miR-761 可通過作用靶點干擾腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲等功能[11]。不同腫瘤中miR-761發揮的作用亦不同，在乳腺癌、肝癌等腫瘤中miR-761 可作為原癌基因促進腫瘤發生、發展，在結直腸癌等腫瘤中miR-761 可發揮抑癌基因的功能[12]。本研究結果中，miR-761 在高血壓NSCLC 患者癌組織中高表達，與Zhang 等[13]研究中miR-761 的趨勢基本一致；且與腫瘤大小、組織分化程度、淋巴結轉移、TNM 分期等臨床病理參數有一定的關系。這說明miR-761 可能通過靶向作用其下游因子，影響腫瘤的侵襲和遷移，進而參與高血壓NSCLC 的病情進展。此外，本研究中miR-761 高表達高血壓NSCLC 患者五年生存率（31.11%）低于miR-761 低表達患者（59.09%），且miR-761 是影響患者預后的獨立危險因素。進一步提示miR-761 高表達不利于患者預后，其高表達后可能影響腫瘤細胞的轉移，加速患者病情進展，縮短其生存期。

TIMP-2 是基質金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）抑制因子的一種，可激活MMP，同時又能與激活后的MMP 結合，參與腫瘤的發生、發展[14]。研究表明，TIMP-2 在 NSCLC 患者血清中呈明顯低表達[15]。本研究結果顯示，與高血壓NSCLC 患者癌旁組織及單純NSCLC 患者癌組織相比，高血壓NSCLC 患者癌組織TIMP-2 表達水平降低，與黃茜等[16]及He 等[17]研究結果相似；且TIMP-2 低表達患者腫瘤≥3.0 cm、有淋巴結轉移、組織低分化、TNM Ⅲ-Ⅳ期患者比例高于TIMP-2 高表達患者。提示NSCLC 患者TIMP-2 低表達，而合并高血壓會進一步降低TIMP-2 的表達量，TIMP-2有望作為淋巴結轉移、組織分化等及腫瘤轉移程度的參考指標。此外，本研究中TIMP-2 低表達患者預后較差，其可能是通過影響MMP 的激活和表達，而MMP 可通過調節腫瘤血管新生等，參與腫瘤的侵襲和遷移，影響患者預后。

綜上所述，癌組織miR-761、TIMP-2 表達與高血壓NSCLC 的進展、預后可能有密切聯系，為臨床治療提供新的研究思路，同時對提高高血壓NSCLC的診療效果有重要意義。然而本研究作為回顧性研究，樣本受區域限制且數量有限，miR-761、TIMP-2間的具體作用機制仍需通過動物及細胞試驗驗證，有待今后納入更多樣本進一步深入探究。