黏蛋白-4和基質金屬蛋白酶-7在種植體周病中的表達及意義

姜丹丹周政沈玉鳳唐小雪緱小蕊黃枚鈺童一洲陳苗苗余重慶

1.石河子大學醫學院第一附屬醫院口腔科，石河子832000；2.石河子大學口腔醫學系，石河子832000

種植體周圍疾?。╬eri-implant disease，PD）是導致種植失敗的主要原因[1]，這種疾病狀態分為種植體周圍炎（peri-implantitis，PI）和種植體周圍黏膜炎（peri-implant mucositis，PIM），分別有19.8%和46.8%的患病率[2]，前者的特征是快速發展的、無癥狀的骨吸收[3]，可能導致植體脫落。對口腔修復性治療的成本、效益產生了負面影響[4]。目前尚缺乏對PD的標準治療方案[3]，若采用牙周疾病的治療方案，12個月后疾病復發率高達100%[5]，在這種背景下，更需要重新審視PD的發病機制和早診早治措施[6-8]。

目前監測和診斷PD的傳統指標有影像學骨丟失量、牙周探診深度、探診出血指數、微生物檢測、種植體松動度和化膿等[9]，但這些診斷方法可能不夠敏感或特異，不足以區分疾病的發生、發展和活動階段[10-11]，它們可以檢測出已形成的病損，然而此時疾病已到了中晚期階段，治療成本、難度相較于初期大大增加。冠部形態及穿齦輪廓的設計[12]和術者操作水平、植入位點的不同，影響了臨床參數的標準化。此外，在種植體周圍組織炎癥狀態下，探診時使用牙周探針容易引起結合上皮的刺透及出血[13]；若隨訪資料不完整，傳統診斷方法的診斷敏感性會降低，影響對早期疾病的診斷效果。針對這種復雜性超過臨床診斷能力的多因素疾病，出現了現代醫學的另一個概念——精準醫學[14]，它可以利用現有的臨床和生物學參數，針對每個病例提出高度精確的診斷或治療策略，克服了20世紀“一刀切”醫學方法的局限性。作為實踐精準醫學的一個提法，專家組在牙周和種植體疾病的新分類一文中首次引入了生物標記物這個概念[15]。與PD相關的生物標志物包括一系列促炎細胞因子、趨化因子、單核細胞趨化蛋白、巨噬細胞炎性蛋白和組織破壞酶等[16]，對于正在發生發展的炎癥過程，它們能夠提供客觀、可測量的診斷信息，高靈敏度的診斷分析能夠在臨床表現改變之前捕獲樣本中的濃度變化，從而優化牙周探診中以“毫米”為單位的臨床測量方式。其中，基質金屬蛋白酶（matrix metallo‐proteinases，MMPs）類的臨床應用很突出。牙周病原菌可誘導宿主細胞分泌MMPs，以往的研究[17]認為MMPs是檢測PD及其嚴重程度的客觀工具。

MMP-7是家族中有最小相對分子質量的成員，它不易被MMPs抑制劑調節[18]，MMP-7能夠處理各種基質和非基質分子[19]，降解各種組織蛋白，包括纖維連接蛋白、明膠、Ⅳ型膠原和彈性蛋白等；MMP-7與許多腫瘤及炎癥性疾病有關。在口腔領域中，牙周炎患者的唾液、齦溝液和牙齦組織中的MMP-7水平升高[20]（P<0.05），體現出MMP-7與牙周炎癥的發生發展有一定的關系。關于PD的研究中，MMP-7能夠激活基質金屬蛋白酶8酶原（pro-matrix metalloproteinase-8，pro-MMP-8），從而潛在地促進疾病進展[21]，表明在種植體周圍疾病的進展過程中，MMP-7與MMP-8可能存在協同作用。

Lundmark等[22]對牙周炎患者進行了基因測序研究，黏蛋白（mucin，MUC）-4與MMP-7基因分列高度上調的基因第一、二位，表明了這兩種標記物與牙周炎癥之間的強相關性，且后續研究[23]中，兩因子聯合對牙周炎癥的診斷曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.931，表現出很強的診斷效能。MMP-7和MUC-4可能共同參與炎癥的過程，研究它們對PD的作用將有助于初探這些標志物對PD的潛在診斷能力。由于MMP-8是齦溝液中含量最豐富的膠原酶[10]，是監測種植體周圍狀態最合適的生物標記物，在種植體周圍炎癥樣本中的表達水平對疾病診斷有意義。本研究檢測了種植體周圍齦溝液（peri-implant crevicu‐lar fluid，PICF）中用于PD診斷的MMP-8、MMP-7、MUC-4生物標記物的水平。

1 材料和方法

1.1 研究對象

從2014年7月—2017年7月間在石河子大學第一附屬醫院口腔科接受后牙區種植義齒修復、負載2～5年的患者中選擇63名受試者，入選對象滿足以下納入標準，并通過醫院倫理委員會審核（倫理批件號：2019-095-02），研究前患者簽署知情同意書。

納入標準：1）實驗前6個月未服用抗生素、鈣通道阻滯劑、苯妥英鈉、環孢菌素等藥物；2）無影響種植體周病理改變的系統性疾?。ㄌ悄虿?、骨質疏松癥、關節炎、抑郁癥等）；3）每天吸煙<10支；4）有定期（半年/1年）進行齦上潔治的習慣。

排除標準：1）1年內行種植體周圍疾病手術治療；2）6個月內服用抗生素、鈣通道阻滯劑、苯妥英鈉、環孢菌素等藥物；3）重度牙周炎；4）懷孕或哺乳期女性；5）為避免醫源性因素的影響，排除有生物力學過載和粘接劑殘留跡象的種植體支持修復體。

1.2 分組

參考2018年歐洲牙周病與植體周病新分類國際研討會共識性報告[24]，進行分組，具體如下。

1.2.1 PI組（n=24） 臨床標準：1）植體周圍軟組織炎癥，如膿液溢出、腫脹、疼痛等；2）探診出血（bleeding on probing，BOP）陽性；3）探診深度（pocket probing depth，PPD）較基線增加；4）PPD≥6 mm。種植體X線攝影檢查標準：1）種植體周圍骨丟失與初期愈合相比≥2 mm；2）存在進行性骨喪失。滿足臨床標準及X線片標準中任何一條即可。

1.2.2 對照組（n=39） 臨床標準：1）種植體周圍組織與正常牙周組織不存在明顯區別；2）無BOP；3）PPD≤5 mm；4）PPD和基線對比無明顯變化；5）種植體植入以來，無疼痛、無松動、無滲出物史。X線片表現：1）即使種植體周圍PPD較深，牙齦乳頭輕度退縮，但無種植體周圍骨流失（或種植體周圍骨流失較愈合初期<2 mm）；2）可能存在過種植體周圍牙槽骨吸收，但此時骨吸收處于靜止狀態，沒有進行性骨喪失。

1.3 記錄受試者的一般情況

經受試者知情同意，采用問卷調查法，對受試者的一般人口學資料、既往病史、家族史、生活方式、行為習慣等進行調查，并進行種植體狀況檢查和實驗室檢查。

1.4 種植體周圍軟硬組織評價

所有測量均由2名經驗豐富的檢查人員在校準后進行，證明PPD測量的95.7%一致性在“±1 mm”范圍內。所有口腔內種植體的臨床檢查、測量均采用Hu-Friedy樹脂探針，以“mm”為單位，對每個植體施加0.15 N·cm-1的力。在口腔內存在多個種植體的情況下，選擇炎癥情況下臨床狀況最差的種植體和健康情況下最易行探診操作的種植體作為代表，記錄每個種植體：1）6個位點的PPD，結果取6個位點均值；2）4個位點的BOP、牙齦指數（gingival index，GI）、改良菌斑指數（modified plaque index，mPLI），結果分別取4個位點的總和。

記錄種植體周圍骨水平變化：自基線（修復后即刻）至研究時間點拍攝的標準化全景放射照片，這一個周期間的植體邊緣骨高度差異。種植體長度用于校正全景扭曲。

1.5 PICF的采集

取樣之前，用無菌刮匙除去齦上菌斑，噴槍輕輕吹干植體頸部，隔濕，將尖端剪去2 mm的25號吸潮紙尖插入頰側3個位點（近頰、頰面中央、遠頰）的齦溝內，存在輕微阻力則停止，每間隔10 s插入下一個位點，放置30 s后取出吸潮紙尖（丟棄被血液染色、唾液污染的樣本，另選其他種植體）；間隔30 s后，按上述方法在舌側作一次（近舌、舌面中央、遠舌位點），然后將6條吸潮紙尖置于EP管中，-80℃冷凍保存。

1.6 樣本檢測

所有樣本于同一日測試，實驗前將保存于-80℃的PICF樣本于室溫下解凍，加入PBS緩沖液（pH=7.4），室溫下震蕩1 h。使用高速離心機以10 000 r·min-1在4℃離心10 min，取離心后的上清液分裝于另外3個潔凈的EP管中，登記編號。用MMP-7、MUC-4、MMP-8試劑盒測定其中MMP-7、MUC-4和MMP-8的含量。使用酶標儀（Biotek公司，美國）進行讀數，波長設置為450 nm，校正設置為540 nm，以減去背景。低于檢測限的樣品設為0。

1.7 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，計量資料服從正態分布則采用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法；不服從正態分布采用中位數和四分位間距表示，組間比較采用非參數秩和檢驗；計數資料以頻數和百分比表示，組間比較采用卡方檢驗或非參數秩和檢驗；指標間的相關性采用Spearman相關分析；采用ROC曲線分析MMP-8、MMP-7、MUC-4及其三者間對種植體周圍炎癥的診斷價值；檢驗水準為α=0.05，P<0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

按照研究對象的納入排除標準收集63名患者的基本信息，PI組男性13名（54.2%），女性11名（45.8%），平均年齡（49.08±12.41）歲；健康組男性22名（56.4%）和女性17名（43.6%），平均年齡（50.72±11.94）歲。統計分析顯示，2組受試者年齡、性別等基本情況差異無統計學意義。PI組受試者的PPD水平大于對照組（P<0.001），BOP、GI的構成比在2組中差異均具有統計學意義（P<0.05）；mPLI的構成比在2組中差異無統計學意義，具體情況見表1。

表1 組間數據對比Tab 1 The comparison between groups

2.2 MMP-7、MUC-4和MMP-8在PICF中的水平

MMP-7、MMP-8、MUC-4數值為計量資料，數據經正態檢驗，服從正態分布，故使用兩獨立樣本的t檢驗。PI組和對照組MMP-7的測量結果分別為（20.27±6.16）、（16.67±3.19）pg·mL-1，MMP-8的 測量 結 果 分 別為（36.29±11.43）、（19.68±10.33） pg·mL-1，MUC-4的 測 量 結 果 分 別 為（3.11±1.51）、（5.79±3.31）pg·mL-1，PI組中MMP-7和MMP-8的表達水平高于對照組（t=-2.581，P<0.05；t=-5.882，P<0.001），但MUC-4的表達水平低于對照組（t=4.377，P<0.001）（圖1）。

圖1 PI組和對照組PICF樣本中MMP-7、MMP-8和MUC-4的表達水平Fig 1 The level of MMP-7，MMP-8 and MUC-4 in PICF sam‐plesfrom patientswith peri-implantitisand control group

2.3 MMP-7、MMP-8和MUC-4水平與種植體周圍探診指數的相關性

樣本中MMP-7的水平與PPD呈顯著正相關（r=0.451，P<0.001）；樣本中MMP-8的水平與PPD（r=0.619，P<0.001）、BOP（r=0.478，P<0.001）、GI（r=0.332，P=0.009）呈正相關；樣本中MUC-4的水平與PPD（r=-0.492，P<0.001）、BOP（r=-0.321，P=0.010）、GI（r=-0.396，P=0.001）呈負相關（表2）。

表2 MMP-7、MMP-8和MUC-4與臨床指標的相關系數Tab 2 Coefficient of correlation between clinical parameters and MMP-7，MMP-8 and MUC-4

2.4 ROC曲線分析

MMP-7、MMP-8、MUC-4對PI組均具有一定的診斷效能，其中MMP-8對PI組的診斷效能最好，當MMP-8>21.21時，AUC為0.868，診斷PI的靈敏度為0.96，特異度為0.68；當MMP-7>21.56時，AUC為0.668，診斷PI的靈敏度為0.46，特異度為0.92；當MUC-4≤4.58時，AUC為0.772，診斷炎癥的靈敏度為0.91，特異度為0.56；MMP-7、MUC-4并聯診斷模型的診斷效能高于兩種因子單獨診斷，模型對炎癥的診斷靈敏度為0.96，特異度為0.56（表3，圖2）。

表3 ROC曲線分析MMP-7、MMP-8、MUC-4診斷炎癥效能Tab 3 ROC analysis of MMP-7，MMP-8，MUC-4 in the diagnosis of inflammation

圖2 ROC曲線分析MMP-7、MMP-8、MUC-4診斷炎癥效能Fig 2 ROC analysis of MMP-7，MMP-8，MUC-4 in the diagno‐sis of inflammation

3 討論

PD是一種多因素疾病，多種因素累加會加速炎癥的進程。了解健康組織與炎癥部位之間的免疫學差異，了解哪些因素與軟組織炎癥及骨質的流失相關很重要。本研究評估了PD患者PICF中MMP-7和MUC-4的水平。研究發現，相較對照組，PI組中的MMP-7水平升高，差異有統計學意義（P<0.05），提示MMP-7的表達可能隨著炎癥成分的增加而升高，說明檢測PICF中的MMP-7可能提供一種鑒別炎癥和對照組的診斷能力；其可能機制為：在牙周疾病中，牙周致病菌的脂多糖及其毒力因子可觸發宿主吞噬細胞產生活性氧，引發牙周組織破壞級聯反應，體外研究表明髓過氧化物酶可以利用活性氧，如過氧化氫利用活性氧生成次氯酸，次氯酸將pro-MMP-7轉化為有活性的MMP-7[25-26]，這一機制從一個角度解釋了在PI組樣本PICF中發現的MMP-7表達升高現象，說明MMP-7可能在PD的活動期起作用。本研究在相關性分析中發現MMP-7與PPD呈正相關（r=0.451，P<0.001），這與其他研究[27-28]結果一致，即MMP-7水平隨著牙周病中PPD、牙齒松動和臨床附著喪失等病變的進展而增加。本研究中AUC為0.668，結合組間比較結果后，判斷MMP-7的診斷效能尚可。基于以上研究，MMP-7可以作為監測PD發生發展的一個參考指標，與PD的關系還有較大的探索空間。

本研究中，對照組的MUC-4水平高于PI組（P<0.001），與先前報道[23]關于牙周炎樣本齦溝液和唾液中MUC-4水平下調的結果部分一致。PI組中MUC-4水平降低，可能導致凝集和清潔口腔病原體的能力降低，加速在牙齒上形成生物膜，持續PD患者的炎癥反應。本研究中MUC-4與指數PPD、GI、BOP呈負相關（P<0.05），說明隨著種植體周圍炎癥程度的加深，MUC-4的量下降。研究[29]發現，PPD與MUC-4的降低呈正相關，兩研究間研究結果存在差異，其可能原因為納入研究中的大部分人群常常還未等到炎癥發展至中晚期便接近了隨訪時間，此時僅有探診出血的出現，并不存在探診深度的加深，因此預期MUC的分泌水平不會隨著PPD而增加。焦鵬[30]對牙周治療術前、術后的受試者進行了齦溝液和血清中的MUC-4水平測定，MUC-4水平受牙周狀態影響，進行完善的牙周治療后，隨著牙周狀況的改善，MUC-4在血清及齦溝液中的水平有所回升。提示MUC濃度的增加意味著口腔防御行為的發生。本研究中MUC-4的AUC為0.772，結合組間比較，MUC-4是種植體周圍炎發生的一個負向影響因素，也可作為炎癥診斷時的一個參考指標。

本研究選擇MMP-8作為參照物，因為它突顯出了很高的生物學潛能。有研究者[31]建議使用MMP-8檢測作為唯一的診斷測試。它在PI組中的水平較對照組高（P<0.001），與此前研究[32]結果基本一致，在牙周炎和種植體周圍炎的背景下，口腔液體如唾液、齦溝液和PICF中的MMP-8濃度增加到病理水平；結合MMP-8與牙周探診指數的顯著正相關結果來看，再次驗證了MMP-8可以作為判斷種植體周圍組織狀態的客觀指標這一結論。本研究的ROC診斷實驗中，MMP-8的AUC為0.868，靈敏度為0.96、特異度為0.68，在3個因子中體現出了最高的診斷效能。

本研究中，PI組MMP-7和MMP-8水平均升高，與其他研究[21]一致，MMP-7能激活pro-MMP-8，潛在地促進疾病進展，可能原因為炎癥狀態下牙周組織內的活性氧不僅可以激活與牙周組織破壞相關的主要MMP，即MMP-8和9，還可以激活MMP-7，并且MMP-7可進一步增強這種MMP激活網絡[25-26]，MMP-7可以激活其他MMP的前體（pro-MMP-8和9），從而增強蛋白水解級聯反應[33]；由此推想，在牙周、種植體周圍疾病的進展過程中，MMP-7與MMP-8可能存在協同作用。

牙周炎中上調的基因主要與炎癥、對創傷的反應和細胞凋亡有關，研究[23,30]證明，牙周炎患者的牙齦組織、血清、齦溝液中MMP-7、MUC-4的水平與健康組差異有統計學意義（P<0.05），且隨著牙周炎癥程度的加重，MMP-7的水平上升，MUC-4的水平下降。實施牙周治療后，MMP-7的水平回落，MUC-4的水平回升，趨向于健康狀態，說明它們與牙周疾病的炎癥有一定的相關性，具體發病機制不明[30]。本研究中MMP-7水平隨PPD的加深而增加，MUC-4的水平隨著PPD的加深而下降，與先前研究結果一致，兩者均與PPD有相關性，兩者可以反映PD的進展，有作為監測PD發生發展標志物的潛力。MMP-7、MUC-4兩者聯合診斷的靈敏度為0.96，特異度為0.56，比各自單獨診斷的效能有所提升，并未達到此前牙周炎研究中的水平，不過也體現出了一定的診斷價值，可以為后續相關研究提供一些參考。

相較此前同一種類的研究，本研究只采集了患者的PICF樣本，考慮到唾液中不同種類的蛋白較多，可能影響對PICF中相對低濃度的MMP-7、MUC-4的監測，并未采集唾液進行研究；考慮到成本、受試者依從性等問題，并未采集到血清樣本。本研究中MMP-7、MUC-4聯合沒有此前牙周炎研究[23]中的診斷效能突出，可能影響因素有代表性不強、混雜因素在兩組中分布不均、檢測方法有限等。但若研究條件發生了變化，如進行更大樣本量、多中心、前瞻性的分期研究也許兩者可以體現出更多的診斷價值。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。