生長分化因子11對小鼠顳下頜關節骨關節炎髁突軟骨細胞脂肪化的影響

王若欣劉倩何峰張勉王賀林

1.鄭州大學口腔醫學院，鄭州450052；2.軍事口腔醫學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，陜西省口腔疾病國際聯合研究中心，第四軍醫大學口腔醫院口腔解剖生理學教研室，西安710032；3.軍事口腔醫學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，第四軍醫大學口腔醫院醫療康復科，西安710032

顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）骨關節炎（osteoarthritis，OA）是顳下頜關節紊亂病（temporomandibular disorder，TMD）的重癥表現，14.56%的TMD患者具有TMJOA的影像學征象[1]。TMJ髁突軟骨退變是TMJOA的主要病理改變，髁突軟骨細胞作為TMJ髁突軟骨中唯一的細胞類型，在軟骨退變過程中發揮了決定性作用，但其具體機制仍有待進一步明確。近年來有研究[2]表明脂質代謝異常參與膝關節OA的病變發展，膝關節OA軟骨細胞內可出現明顯的脂肪化改變，但TMJ OA軟骨細胞是否也有類似改變目前尚無報道。

生長分化因子11（growth differentiation factor 11，GDF11）又名骨形態發生蛋白11（bone mor‐phogenetic protein 11，BMP11），屬于轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族，參與了骨骼的發育和牙本質形成[3-4]。近年來有研究發現GDF11可抑制骨髓間充質干細胞向脂肪細胞的分化[5-6]，也能夠減輕低單核細胞及肝細胞的脂質沉積[7-8]。但目前TMJ OA退變軟骨中GDF11的表達是否存在變化仍然缺少研究。

1 材料和方法

本研究通過第四軍醫大學口腔醫院倫理委員會審查（2017倫審字007號）。

1.1 試劑

GDF11抗體（ab124721）、Adiponectin抗體（ab181281）（Abcam公司，英國）；山羊抗兔二抗試劑盒（SP-9001）、復合消化液、抗原修復液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；引物設計及合成由日本Takara公司完成；Trizol溶液（15596026，Thermo Fisher公司，美國）；RNA反轉試劑盒PrimeScript RT Master Mix（RR036A）、實時定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒SYBR Pre‐mix Ex TaqTMⅡ（RR820A）（Takara公司，日本）；DAB顯色試劑盒（CW0125）（泰州康維世紀公司）。

1.2 動物模型建立及分組處理

6周齡雌性C57小鼠（150只）由第四軍醫大學動物中心提供，隨機分為10組，分別為3周對照組、3周UAC實驗組、7周對照組、7周UAC實驗組、11周對照組、11周UAC實驗組、7周UAC+PBS注射組、7周UAC+GDF11注射組、11周UAC+PBS注射組、11周UAC+GDF11注射組，每組實驗動物數量15只。1%戊巴比妥麻醉小鼠后，在左側上、下頜切牙粘接不良修復體。不良修復體利用15號注射針頭制作，上頜不良修復體長度1.5 mm，下頜不良修復體導板長度1.5 mm，套筒管長度2.5 mm，導板與套筒管長軸成45°。隔濕后使用聚羧酸鋅水門汀粘接不良修復體，整個過程在5 min內完成。整個實驗期間保證不良修復體無脫落。對照組小鼠實施同樣操作過程，但是不粘接不良修復體。

7周、11周UAC+PBS注射組/UAC+GDF11注射組小鼠于UAC造模后第二天開始行相關藥物局部注射，1%戊巴比妥麻醉后沿顴弓后部向后上方進針，抵及骨面后將藥物注入，注射量為20μL，隔天注射。

所有小鼠在同樣條件下飼養。在各個實驗時間點處死相應小鼠后，各組左側15個髁突軟骨隨機分為3份，每份5個髁突軟骨；右側10個髁突隨機分為2份，每份5個髁突軟骨，這5份髁突軟骨用于RNA的提取和后續實驗。右側剩余的5個髁突軟骨用于組織染色。

1.3 總RNA提取、反轉和real-time PCR

髁突軟骨液氮冷凍5 min后充分砸碎，收集組織粉末后Trizol法提取總RNA。PrimeScript RT Master Mix試劑盒反轉RNA，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行real-time PCR反應。Ⅱ型膠原（typeⅡcollagen，Col-Ⅱ）、聚蛋白多糖（Ag‐grecan）、Ⅰ型膠原（typeⅠcollagen，Col-Ⅰ）、脂聯素（Adiponectin）、脂肪酸結合蛋4（fatty ac‐id-binding protein 4，FABP4）、脂滴包被蛋白1（Perilipin 1）、內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glycer‐aldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH），引物信息見表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequences of primers

1.4 組織塊處理及染色

分離的TMJ關節組織浸泡于4%多聚甲醛固定液中，固定24 h后10%乙二胺四乙酸（ethylenedi‐amine tetraacetic acid，EDTA）溶液（pH=7.4）脫鈣4周，梯度乙醇脫水后石蠟包埋切片。石蠟切片常規脫蠟至水，參照免疫組化試劑盒說明書中描述的SABC法進行GDF11和Adiponectin免疫組化染色。番紅O染色時，切片新鮮二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水；1%固綠溶液染色2 min，1%醋酸乙醇輕微洗滌10 s；1%番紅O溶液染色5 min，95%乙醇輕微洗滌10～20 s；風干后新鮮二甲苯5 min透明，中性樹膠封片。

1.5 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件對研究結果進行統計分析。所有數據采用平均值±標準差方式表示，同一時間點的兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 構建UAC致小鼠TMJOA模型

對6周齡小鼠施加UAC刺激后，TMJ髁突軟骨呈現典型的OA樣改變（圖1）。與同期正常對照組相比，UAC實驗組小鼠TMJ髁突軟骨厚度在7周及11周后顯著降低（7周：t=3.767，P=0.002 2；11周：t=4.604，P=0.000 2）（圖1和圖2A）。番紅O染色顯示UAC實驗組小鼠TMJ髁突軟骨基質成分大量丟失，番紅O陽性面積在3、7及11周后顯著減少（3周：t=2.942，P=0.018 6；7周：t=5.295，P<0.000 1；11周：t=7.06，P<0.000 1）（圖1和圖2B）。軟骨基質標志分子Col-Ⅱ（3周：t=3.081，P=0.013 1；7周：t=3.852，P=0.001 7；11周：t=3.467，P=0.004 8）（圖2C）和Aggrecan（3周：t=3.621，P=0.003 2；7周：t=3.258，P=0.008 3；11周：t=3.983，P=0.001 2）（圖2D）的mRNA含量在UAC實驗組小鼠TMJ髁突軟骨中顯著降低，而Col-Ⅰ的mRNA含量則顯著升高（3周：t=13.42，P<0.000 1；7周：t=11.13，P<0.000 1；11周：t=10.12，P<0.000 1）（圖2E）。

圖1 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突軟骨番紅O染色結果 番紅O染色 ×200Fig 1 Safranin Ostaining of TMJcondylar cartilagein normal and TMJOA mice safranin O staining ×200

圖2 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突軟骨退變情況對比Fig 2 Comparison of TMJcondylar cartilagein normal and TMJOA mice

2.2 正常對照組和UAC實驗組小鼠髁突軟骨中的脂肪化情況

在正常對照組小鼠TMJ髁突軟骨中，Adipo‐nectin陽性細胞數量極少，而在3周UAC實驗組TMJ髁突軟骨中，淺層和中層出現大量Adiponec‐tin陽性軟骨細胞（t=7.886，P<0.000 1）；在7周和11周時，UAC實驗組TMJ髁突軟骨中Adiponectin陽性軟骨細胞繼續增加，且在全層軟骨廣泛分布（7周：t=10.92，P<0.000 1；11周：t=12.64，P<0.000 1）（圖3和圖4A）。同時，Adiponectin（3周：t=7.025，P<0.000 1；7周：t=3.952，P=0.001 3；11周：t=4.83，P=0.000 1）（圖4B）及另外兩種脂肪化標志分子FABP4（3周：t=6.243，P<0.000 1；7周：t=13.42，P<0.000 1；11周：t=9.625，P<0.000 1）（圖4C）、Perilipin 1（3周：t=5.243，P<0.000 1；7周：t=6.772，P<0.000 1；11周：t=11.14，P<0.000 1）（圖4D）的mRNA含量在3、7及11周的UAC實驗組TMJ髁突軟骨中均顯著增加。

圖3 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突軟骨Adiponectin免疫組織化學染色結果 免疫組織化學染色 ×200Fig 3 Adiponectin immunohistochemical staining of TMJcondylar cartilage in normal and TMJOA mice immunohistochemical staining ×200

圖4 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突軟骨內脂肪化情況對比Fig 4 Comparison of steatosis in TMJcondylar cartilage between normal and TMJOA mice

2.3 正常對照組和UAC實驗組小鼠髁突軟骨中GDF11的表達情況

在正常對照組小鼠TMJ髁突軟骨中，GDF11陽性軟骨細胞在全層軟骨廣泛分布，而在UAC實驗組TMJ髁突軟骨中，GDF11陽性細胞顯著減少，且僅存在于軟骨深層（3周：t=2.815，P=0.025 4；7周：t=6.815，P<0.000 1；11周：t=10.67，P<0.000 1）（圖5和圖6A）。同時，GDF11的mRNA含量在3、7及11周的UAC實驗組TMJ髁突軟骨中均顯著降低（3周：t=2.869，P=0.022 3；7周：t=10.04，P<0.000 1；11周：t=17.57，P<0.000 1）（圖6B）。

圖5 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突軟骨GDF11免疫組織化學染色結果 免疫組織化學染色 ×200Fig 5 GDF11 immunohistochemical staining of TMJcondylar cartilagein normal and TMJOA mice immunohistochemical staining ×200

圖6 正常小鼠和TMJOA小鼠髁突軟骨內GDF11的表達對比Fig 6 Comparison of GDF11 expression in TMJcondylar cartilage between normal and TMJOA mice

2.4 GDF11局部注射對TMJOA髁突軟骨的影響

對UAC實驗組小鼠在TMJ周圍局部分別注射GDF11和PBS。與PBS注射組相比，在GDF11持續注射7周和11周后，TMJ髁突軟骨厚度（7周：t=3.136，P=0.010 4；11周：t=5.645，P<0.000 1）（圖7A、B）和番紅O陽性面積（7周：t=4.772，P=0.000 2；11周：t=4.989，P=0.000 1）（圖7A、C）均顯著增加；軟骨基質標志分子Col-Ⅱ（7周：t=5.029，P=0.000 1；11周：t=4.67，P=0.000 3）（圖8A）和Aggrecan（7周：t=5.276，P<0.000 1；11周：t=7.738，P<0.000 1）（圖8B）的mRNA含量在GDF11注射組小鼠髁突軟骨中顯著增加，而Col-Ⅰ的mRNA含量則顯著減少（7周：t=17.44，P<0.000 1；11周：t=14.39，P<0.000 1）（圖8C）。與PBS注射組相比，在GDF11持續注射7周和11周后，TMJ髁突軟骨中Adiponectin陽性細胞數量顯著降低（7周：t=5.864，P<0.000 1；11周：t=8.487，P<0.000 1）（圖7D、E）；同時Adiponectin（7周：t=4.973，P=0.000 1；11周：t=8.033，P<0.000 1）（圖7F）、FABP4（7周：t=4.549，P=0.000 4；11周：t=5.003，P=0.000 1）（圖8D）及Perilipin 1（7周：t=3.807，P=0.002 2；11周：t=6.662，P<0.000 1）（圖8E）的mRNA含量也顯著降低。

圖7 PBS注射和GDF11注射小鼠髁突軟骨退變、脂肪化情況對比Fig 7 Comparison of degeneration and steatosis in TMJcondylar cartilage between micewith PBSor GDF11 injection

圖8 PBS注射和GDF11注射小鼠髁突軟骨退變、脂肪化相關分子表達對比Fig 8 Comparisonof molecular expression related todegenerationand steatosisin TMJcondylar cartilagebetweenmicewith PBSor GDF11injection

3 討論

TMJOA是TMD的重癥表現，主要病理改變為TMJ髁突軟骨的退變，但是目前TMJOA的致病因素尚未完全明確。在臨床最常見的膝關節和髖關節OA發病過程中，異常生物力刺激起到了關鍵性的作用[10]。對于TMJ而言，在行使咀嚼功能時將承受生物力的刺激，而異常咬合將可能導致TMJ承受的生物力環境發生改變，進而誘發TMD甚至TMJOA[11]。在本研究中通過構建UAC改變小鼠的TMJ生物力學環境，成功在TMJ誘導出OA樣的軟骨退變，進一步證實了咬合異常因素在TMD和TMJOA發病中的關鍵作用。

OA的主要病理改變是軟骨組織的退變，而軟骨細胞作為軟骨組織中唯一的細胞類型，在維持軟骨穩態方面發揮了核心作用，軟骨細胞功能活動的異常將不可避免地影響整個軟骨的健康。近年來研究發現軟骨細胞脂質代謝與OA發病有重要關聯[12]，脂質代謝異常將導致軟骨細胞內出現脂肪堆積等脂肪化表現，脂肪化程度則和OA嚴重程度呈現正相關關系[13-14]。在本研究中正常對照組小鼠TMJ髁突軟骨內基本沒有細胞脂肪化的表現，而TMJOA小鼠髁突軟骨內Adiponectin、FABP4、Perilipin 1等脂肪化標志分子的表達顯著升高，提示在TMJOA的髁突軟骨中也存在軟骨細胞脂肪化的表現。而且在3周時Adiponectin陽性細胞主要分布于TMJ髁突軟骨的淺層和中層，在7周和11周時在軟骨全層廣泛表達，這一結果提示淺層和中層的TMJ髁突軟骨細胞更容易在異常生物力刺激下發生脂質代謝的異常，出現軟骨細胞的脂肪化。

GDF11已被證實可以抑制骨髓間充質干細胞向脂肪細胞分化[5-6]，還可以抑制單核細胞[7]、肝細胞[8]內的脂質沉積，因此具有明確的抗脂肪化作用。本研究發現在正常對照組小鼠TMJ髁突軟骨中，GDF11在軟骨全層廣泛高表達，而在TMJOA軟骨中GDF11表達顯著降低，且3周時主要在淺層和中層降低，7周和11周時全層降低。結合3周時軟骨細胞脂肪化主要出現在髁突軟骨的淺層和中層，7周和11周時出現在軟骨全層的現象，提示GDF11的減少可能是TMJOA中軟骨細胞脂肪化的重要原因。為進一步明確GDF11的抗脂肪化作用，本研究對TMJOA小鼠進行外源性GDF11的局部注射，注射組小鼠的TMJ軟骨厚度和基質含量均有顯著提升，且明顯抑制了軟骨細胞脂肪化，提示GDF11有望作為新型治療藥物用于OA的治療，在抑制軟骨細胞脂肪化進而延緩軟骨退變方面發揮積極作用。與本研究結果相似，有文獻[13]指出對老年小鼠給予GDF11后可以顯著減輕膝關節軟骨的增齡性退變，同樣提示GDF11對于關節軟骨的積極保護作用。

綜上所述，異常咬合可以誘導TMJ髁突軟骨出現OA病變，在TMJOA髁突退變軟骨中存在廣泛的軟骨細胞脂肪化，補充外源性GDF11可以有效地抑制軟骨細胞脂肪化進而緩解髁突軟骨退變程度。GDF11有望成為新的OA治療藥物，但目前GDF11抑制軟骨細胞脂肪化的具體機制仍然不明，需要后期進一步的研究和探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。