INPP4B調控Akt信號通路抑制胃癌HGC-27細胞增殖并誘導細胞凋亡

商倩 陳鑫 王邦茂 楊波 朱蘭平

(1天津醫科大學總醫院消化內科，天津 300041；2保定市第一醫院消化內科)

惡性腫瘤已經成為目前威脅人類生命健康的常見疾病之一，其具有惡性程度高、致死率高、病程快等特點，研究惡性腫瘤分子發生機制，尋找有效的靶基因抑制惡性腫瘤進程是目前研究的熱點〔1〕。脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)作為一種脂質磷酸酶，其對細胞內磷酸激酶穩態的維持具有關鍵作用〔2〕。INPP4B參與細胞增殖和凋亡調控過程，其是目前研究發現的與腫瘤有關的調節基因〔3〕。研究顯示，INPP4B在卵巢癌中表達下調，上調其表達可以誘導卵巢癌細胞凋亡〔4〕。后續的實驗研究證實，INPP4B在乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中均扮演抑制作用，INPP4B可以通過調控蛋白激酶B(Akt)信號通路的激活水平發揮生物學作用〔5,6〕。目前已知INPP4B在胃癌組織中表達下調，并且其表達水平的高低與胃癌分化程度以及TNM分期相關，INPP4B可能是胃癌進展中的抑制因子〔7〕。現階段對于INPP4B在胃癌細胞增殖、凋亡中的作用還不明確。本研究旨在探討INPP4B在胃癌細胞和正常胃黏膜細胞中的表達差異，通過慢病毒感染的方式上調胃癌細胞中INPP4B的表達水平，明確INPP4B對胃癌細胞增殖和凋亡的影響和機制。

1 材料與方法

1.1材料 胃癌細胞AGS、HGC-27、NCI-N87購自上海慧穎生物科技有限公司；正常胃黏膜細胞GES-1購自上海艾研生物科技有限公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；INPP4B過表達慢病毒和對照慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司合成；Bcl-2抗體購自青島捷世康生物科技有限公司；p-Akt抗體購自廈門研科生物技術有限公司。

1.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)方法測定INPP4B在胃癌細胞中的表達 收集胃癌細胞AGS、HGC-27、NCI-N87和正常胃黏膜細胞GES-1，提取細胞總RNA，合成cDNA。cDNA合成體系為：2 μl的隨機引物、20 μl的2×TS反應混合物、2 μg總RNA、2 μl的去除DNA、2 μl的TransScript RT/RI Enzyme Mix，添加無RNA酶水至40 μl。cDNA合成條件為：25℃孵育10 min；42℃孵育30 min；85℃孵育5 min；4℃終止反應。收集cDNA，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測，引物為：INPP4B正義鏈-5′-GGAAAGTGTGAGCGGAAAAG-3′，反義鏈-5′-CGA ATTCGCATCCACTTATTG-3′。β-actin正義鏈-5′-TA GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反義鏈-5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。反應體系為：10 μl的2×TS Top Green qPCR SuperMix、0.3 μl的上下游引物、0.4 μl的Passive Reference Dye、0.5 μl的cDNA，添加ddH2O至10 μl。PCR條件設置為：95℃ 50 s，74℃ 5 s，60℃ 34 s。INPP4B mRNA定量方法為2-△△Ct法。

1.3Western印跡測定INPP4B在胃癌細胞中的表達 收集胃癌細胞AGS、HGC-27、NCI-N87和正常胃黏膜細胞GES-1，提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)方法檢測蛋白濃度。使用5%的濃縮膠和8%的分離膠進行電泳，蛋白上樣量為30 μg。提取的蛋白樣品在添加至上樣孔之前與結合緩沖液混合煮沸5 min。初始電壓為60 V，觀察預染Marker進入到分離膠時，把電壓調整到90 V。取出凝膠，以半干法將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)上，轉膜時電壓調整為15 V，轉膜時間設置為50 min。PVDF膜分別依次放在封閉液(5%牛血清白蛋白)、一抗(以1∶100稀釋)、二抗(以1∶4 000稀釋)反應液中充分結合。在PVDF膜上滴加ECL超敏發光工作液，以Bio-rad采集圖像，根據灰度值分析蛋白表達量，內參為β-actin。

1.4慢病毒感染 HGC-27細胞接種到6孔板中，培養24 h以后，以MOI=30進行慢病毒感染，培養24 h以后換液，繼續培養72 h以后，用嘌呤霉素篩選5 d后用于后續實驗。將感染INPP4B過表達慢病毒和對照慢病毒的HGC-27細胞命名為INPP4B和NC組，把沒有添加慢病毒液的HGC-27細胞命名為Control組。收集Control、NC、INPP4B組細胞，用實時熒光定量PCR和Western印跡測定細胞中INPP4B表達變化，步驟同1.2和1.3。

1.5四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定上調INPP4B對HGC-27細胞增殖影響 Control、NC、INPP4B組按照每孔4 000個細胞種植到96孔板，在細胞培養48 h以后取出細胞培養板，在每個孔內依次添加MTT工作液各20 μl，孵育4 h以后將上清棄掉。在每個孔中加入150 μl的DMSO溶液，孵育震蕩10 min以后，在酶標儀上檢測490 nm的A值。

1.6流式細胞術測定上調INPP4B對HGC-27細胞凋亡影響 收集Control、NC、INPP4B組細胞(每組106個細胞)，用PBS溶液洗滌3次以后，添加200 μl的結合緩沖液將細胞懸浮，再添加Annexin V-FITC和PI染色液各5 μl，置于避光條件下孵育結合15 min。用流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.7Western印跡測定上調INPP4B對HGC-27細胞Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表達影響 收集Control、NC、INPP4B組細胞，按照1.3中Western印跡測定細胞中Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表達，Bax、Bcl-2、p-Akt抗體稀釋倍數分別為1∶600、1∶800、1∶400。

1.8Akt信號激活劑對上調INPP4B的HGC-27細胞增殖、凋亡影響 將感染INPP4B過表達慢病毒的HGC-27細胞用含50 ng/ml AKT信號通路激活劑IGF-1的細胞培養液培養，記為INPP4B+IGF-1組，以INPP4B組細胞作為參照，細胞培養48 h以后，按照1.5中MTT比色法測定細胞增殖，按照1.6中流式細胞術方法測定細胞凋亡，按照1.7中Western印跡測定Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表達。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1INPP4B在胃癌細胞中表達下調 胃癌細胞AGS、HGC-27、NCI-N87中INPP4B蛋白和mRNA水平明顯低于正常胃黏膜細胞GES-1(P<0.05)；胃癌細胞HGC-27中INPP4B蛋白和mRNA水平明顯低于胃癌細胞AGS、NCI-N87(P<0.05)。見圖1、表1。INPP4B在胃癌細胞中表達下調，選用表達水平最低的胃癌細胞HGC-27作為研究對象。

圖1 Western印跡檢測INPP4B在胃癌細胞中的表達變化

表1 正常胃黏膜細胞GES-1和胃癌細胞AGS、HGC-27、NCI-N87中INPP4B mRNA和蛋白水平

2.2INPP4B慢病毒感染上調HGC-27細胞中INPP4B表達水平 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細胞中INPP4B蛋白和mRNA水平均明顯升高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測INPP4B慢病毒感染后HGC-27細胞中INPP4B蛋白表達

2.3上調INPP4B抑制HGC-27細胞增殖并誘導細胞凋亡 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細胞A值明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，Bax蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖3、圖4。上調INPP4B抑制HGC-27細胞增殖并誘導細胞凋亡。

圖3 流式細胞術檢測上調INPP4B對HGC-27細胞凋亡影響

圖4 Western印跡檢測上調INPP4B對HGC-27細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達影響

2.4上調INPP4B抑制HGC-27細胞中p-Akt蛋白表達 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細胞中p-Akt蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2、圖5。

圖5 Western印跡檢測INPP4B慢病毒感染后HGC-27細胞中p-Akt蛋白水平

2.5Akt信號激活劑對上調INPP4B的HGC-27細胞中p-Akt蛋白表達影響 INPP4B+IGF-1組p-Akt蛋白(0.62±0.06)明顯高于INPP4B組(0.34±0.06，P<0.05)。見圖6。

圖6 Western印跡檢測Akt信號激活劑對INPP4B慢病毒感染后HGC-27細胞中p-Akt蛋白表達影響

2.6Akt信號激活劑對上調INPP4B的HGC-27細胞增殖和凋亡影響 Akt信號激活劑IGF-1處理INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細胞，細胞A值明顯升高，凋亡率明顯降低，細胞中Bax蛋白表達明顯減少，Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)。見圖7、圖8、表3。

圖7 流式細胞術檢測Akt信號激活劑對INPP4B慢病毒感染后HGC-27細胞凋亡影響

圖8 Western印跡檢測Akt信號激活劑對INPP4B慢病毒感染后HGC-27細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達影響

表3 Akt信號激活劑處理INPP4B慢病毒感染后的HGC-27細胞A值、凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

3 討 論

INPP4B基因定位在人4號染色體上，具有C2脂質結合域、磷酸酶結構域和內部神經質同源結構域2，其可以去磷酸化磷脂酰肌醇而維持細胞內磷脂酰肌醇的穩態〔8〕。INPP4B與腫瘤細胞的增殖和凋亡有關，其可以抑制惡性腫瘤的生長，INPP4B被認為是一種抑癌基因〔4〕。上調INPP4B后的宮頸癌、乳腺癌細胞增殖能力明顯下降，細胞凋亡增多〔5,9〕。INPP4B在胃癌組織中表達下調，并且INPP4B表達變化與胃癌患者的TNM分期有關〔7〕。本研究結果表明INPP4B在胃癌細胞中表達下調，上調INPP4B可以抑制胃癌細胞的增殖并誘導胃癌細胞凋亡，說明INPP4B在胃癌中扮演抑制作用，這與上述研究結果相一致。細胞的凋亡是一個復雜過程，其受到細胞內多種信號和基因的表達調控作用〔10〕。與細胞凋亡有關的調控蛋白有多種，其中Bcl-2是最為重要的與凋亡有關的蛋白家族之一〔11〕。Bcl-2蛋白家族成員在細胞凋亡過程中扮演的角色不同，其蛋白成員可以分成促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白〔12〕。Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，在細胞凋亡發生時發揮誘導作用；Bcl-2在細胞凋亡發生時發揮抑制作用〔13～15〕。本研究結果說明上調INPP4B誘導胃癌細胞凋亡發生。

INPP4B作用機制與細胞內信號轉導過程有關。INPP4B是位于Akt信號通路上的一種蛋白酶，其可以作用于磷脂酰肌醇的D4磷酸基團，降低Akt的活化水平，從而阻斷Akt信號激活〔16，17〕。Akt是一個多功能信號通路，與細胞的生長、分化及胚胎發育等有關，參與心血管系統疾病、免疫疾病的發生〔18～20〕。Akt在腫瘤組織中過度激活，其活化水平的高低與Akt磷酸化水平有關，p-Akt蛋白水平越高，Akt信號通路激活水平也就越高〔21，22〕。在卵巢癌中證實，INPP4B可以通過下調Akt信號通路的激活水平誘導細胞凋亡發生〔4〕。本研究結果說明INPP4B抑制胃癌細胞增殖和誘導胃癌細胞凋亡與調控Akt信號通路有關。