肺腺癌關鍵基因的鑒別及預后

黃河 李成長 彭燕 姜洪波

(1新鄉市中心醫院(新鄉醫學院第四臨床學院)呼吸與危重癥醫學科一，河南 新鄉 453000；2新鄉醫學院基礎醫學院生理學與病理生理學系；3新鄉醫學院第三附屬醫院營養科)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤,是全球范圍內癌癥相關死亡的主要病因。肺癌分為小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)， 肺腺癌是最常見的NSCLC亞型〔1〕。肺腺癌的發病率為(283～ 489)/10 萬人。 盡管癌癥治療取得了進展，但肺腺癌的5年生存率僅為14.6%〔2〕。肺腺癌初期癥狀不明顯，往往容易被忽視，等疾病癥狀明顯時已經處于晚期。晚期的治療手段有放療、化療、免疫檢查點抑制劑治療和分子靶向治療等，其中分子靶向治療是晚期肺腺癌的一個重要的治療手段。阿來替尼和吉非替尼是晚期肺腺癌治療的常見分子靶向藥物。盡管這兩種藥物上市時間相差近20年，但臨床研究發現兩者在腺癌患者中都出現了不同程度的耐藥〔3,4〕。出現這種現象的原因是腫瘤具有異質性，在不同空間和時間條件下，即使同一種腫瘤其生物學特性也會有很大不同〔5,6〕。基于此，需要開發更多的分子靶向藥物對不同亞型的肺腺癌進行治療。

為探索有效的肺腺癌分子治療靶標，許多學者就該病的發病機制開展了大量探索。Yuanhua 等〔7〕的研究發現角蛋白16過表達通過促進上皮-間質細胞轉化誘發肺腺癌，角蛋白16因此可作為肺腺癌發生發展及預后標志物。Yerukala 等〔1〕利于優化支持向量的方法對miRNA表達譜芯片進行分析，結果發現了18個miRNA腫瘤標志物，這些標志物與腺癌的發生密切相關。Richardson等〔8〕的研究表明波形蛋白是成纖維細胞活動導致腫瘤細胞侵襲所必需的物質，它通過腫瘤細胞-成纖維細胞的相互作用參與肺腺癌轉移。綜上，肺腺癌方面的研究很多，每個學者都強調自己所研究的信號分子可作為肺腺癌分子治療的靶標，但癌癥是一種多因素誘發多基因突變引起的疾病，參與其發生發展的基因很多，要從大量信號分子中找到關鍵作用的靶標仍然是一件非常困難的事，傳統的動物實驗方法效果不佳，只能揭示該疾病發生發展的冰山一角。基于此，本課題利于生物信息學方法構建導致腺癌發生發展的蛋白互作網絡，利用圖論的相關算法尋找肺腺癌發病的關鍵基因。

1 材料與方法

1.1基因表達數據的獲取 基因芯片表達數據集(GSE10072)來源于基因表達數據庫(GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，實驗樣本取自肺腺癌組織(58例)和正常組織(49例)，實驗平臺是GPL96(HG-U133A：Affymetrix Human Genome U133A Array)。

1.2差異基因分析 差異基因分析使用GEO提供的在線工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)完成，該工具基于R語言的limma包和GEOquery包比較肺腺癌組織與正常肺組織的基因表達差異， 研究結果為根據顯著性差異排序的基因列表。P<0.05且|Log2FC|>1為表達顯著性變化的差異基因的篩選標準。

1.3差異基因的富集分析 用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)基因在線富集分析工具對所有差異基因進行基因本體論(GO)與京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析。GO富集分析主要包括GO生物過程(biological process)、細胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)3個方面。KEGG富集分析主要對經典的生物學通路進行富集分析。

1.4利用STRING數據庫構建差異基因的蛋白互作網絡 STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)是一個可用于搜尋蛋白質之間相互作用關系的數據庫。互作關系的依據來源于實驗數據、生物信息學方法預測及PubMed文獻信息的數據挖掘。差異基因的蛋白互作網絡構建比較簡單，登陸STRING數據庫，數據輸入采用Multiple Proteins模式，參數均采用默認數值，可信度為0.40，物種為人。輸入所有差異基因相應的基因名，即可生成蛋白互作網絡。

1.5關鍵基因的鑒別 將STRING數據庫所生成的互作網絡數據導出，利用Cytoscape軟件對互作網絡進行可視化，CytoHubba是Cytoscape軟件的一個插件，集成了11種可用于關鍵基因選擇算法，這些算法分別基于節點的連接度(degree)、邊緣滲出組件(EPC)、最大鄰居組件(MNC)、最大鄰居組件的密度(DMNC)、最大團中心性(MCC)、瓶頸值(BN)、緊密度(closeness)、偏心度(Eccentricity)、應力(stress) 、發散性(radiality)和中介性(betweenness)等進行關鍵基因的鑒別。研究表明MCC法準確度相對更佳，本課題因此采用MCC算法分析網絡的拓撲結構，進而選取排名前十位的基因即關鍵基因。

1.6生存分析 生存分析(Survival analysis)是研究疾病影響因素與生存時間和結果相關關系的數據分析方法。腫瘤基因的生存分析使用Kaplan Meier plotter( http://kmplot.com/analysis/)在線工具完成，該數據庫包含10 461個癌癥及存活樣本的數據，可用于評估54 675個基因對患者生存時間的影響。為研究MCC算法所選取的關鍵基因對預后是否有影響，本研究所選取的關鍵基因都利用該分析工具進行生存分析，數據分析參數均采用網站默認數值。

2 結 果

2.1差異表達基因 對58例肺腺癌和49例正常肺組織樣本進行基因表達的差異分析，共產生855個差異基因，其中有558個下調基因，297個上調基因。

2.2GO和KEGG富集分析 肺腺癌和正常肺組織差異表達基因的 GO 富集分析結果顯示：顯著富集的生物學過程包括細胞黏附、細胞外基質組織、白細胞遷移、對藥物的反應、膠原分解代謝過程、對機械刺激的反應、對雌二醇的反應、對缺氧的反應、血管生成和基因表達的正調節。與肺腺癌發生相關的顯著富集細胞組分有：細胞外空間、細胞外泌體、蛋白質性細胞外基質、細胞表面、細胞外區域、細胞外基質、細胞表面質膜的整體成分、膠原蛋白三聚體、膜筏和質膜。GO分子功能顯著富集于肝素結合、蛋白質結合、蛋白質同源二聚化活化、鈣離子結合、整合素結合、相同蛋白的結合、轉錄激活因子活化、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區序列特異性結合、蛋白激酶結合、肌動蛋白結合 。KEGG富集分析顯示顯著富集的生物學通路包括阿米巴病、癌癥途徑、細胞周期、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、細胞黏附分子通路、黏附斑通路、p53信號通路、蛋白消化與吸收、細胞外基質(ECM)-受體互作、補體與凝血級聯通路。

2.3差異基因蛋白質互作網絡的構建 利用顯著富集在GO生物過程的相關差異基因，構建蛋白質互作網絡，所構建網絡節點數為334、邊數為1 962、平均節點度為11.7、局部聚類系數為0.434、PPI富集P<0.001。見圖1。圖中節點代表蛋白，節點之間的連線代表蛋白之間的有直接互作關系。

圖1 利于數據庫構建的差異基因蛋白質互作網絡

2.4關鍵基因選取 基于MCC算法對差異基因構建的蛋白互作網絡的拓樸結構進行分析，連接度排名前十的基因，即我們選取的10個關鍵基因分別是：細胞周期蛋白(CCN)B1、紡錘體檢測點蛋白(BUB1B)、極光激酶(AURK)A、生存素(BIRC5)、Xklp2靶蛋白(TPX2)、胞質分裂蛋白調節因子(PRC)1、細胞周期有絲分裂紡錘體檢測點絲/蘇氨酸激酶(BUB1)、有絲分裂阻滯缺陷2樣蛋白(MAD2L)1、著絲粒蛋白(CENP)F和周期素依賴性激酶抑制因子(CDKN)3。見圖2。

這些節點為根據MCC算法選取的關鍵基因，顏色越深，代表基因的重要度越高，顏色越淺，代表基因的重要性越低圖2 基于MCC算法所選取的關鍵基因

2.5生存分析 利用Kaplan Meier生存分析分別對選取的10個關鍵基因進行分析，結果表明這些基因高表達，肺癌患者的總體存活時間顯著縮短(P<0.05)。見圖3。

圖3 關鍵基因的Kaplan Meier生存分析結果

3 討 論

本課題分析的差異基因均是與肺癌的發生與發展密切相關，10個關鍵基因的過表達與患者生存時間顯著減少密切相關。Gao等〔9〕利用生物信息學方法結合實時定量PCR發現CCNB1、CCNB2、CCNA2、神經元PAS結構域蛋白(NPAS)2、鳥嘌呤核甘酸結合蛋白γ-7(GNG7)、幾丁質酶(CHIA)和葡萄糖轉運體(SLC2A)1是肺腺癌發生發展的關鍵基因，最重要的基因CCNB1跟本研究一致，但其余的基因明顯不同，腫瘤的空間和時間異質性是造成這種差異的重要原因。Chen等〔10〕的研究發現BUB1B基因敲除可抑制肺腺癌離體細胞系的增殖。Song等〔11〕的研究表明BUB1B可能是肺腺癌發生發展的關鍵基因，目前尚未發現BUB1B在體方面的臨床研究。Zhang等〔12〕研究表明AURKA和TPX2的mRNA水平升高與吸煙相關肺腺癌的預后不良相關。Cao等〔9〕研究表明BIRC5在肺腺癌中的表達顯著上調并與患者的預后明顯相關。Zhan等〔13〕研究表明PRC1可能通過Wnt/β-catenin信號傳導途徑參與肺腺癌的腫瘤發生。He等〔14〕通過基因集富集分析和薈萃分析顯示BUB1是調節和控制肺腺癌預后的關鍵基因。Shi等〔15〕發現MAD2L1對肺腺癌的預后具有重要的意義。整合分析發現CENPF和BUB1B在肺腺癌的發生和發展中可能發揮了重要的作用，并具有一定的預后價值〔11〕。細胞和組織水平的研究表明CDKN3可能通過促進有絲分裂活性增強，引起肺腺癌的發生〔16〕。

綜上，本課題研究的肺腺癌關鍵基因跟此前的報道既有相同之處，又有區別，腫瘤具有異質性可能是造成本研究與前人成果差異的重要原因。本課題所篩選肺腺癌的關鍵基因大多數都得到前人研究結果的支持，這些關鍵基因高表達與肺腺癌患者較差的預后有明顯的相關性，這些關鍵基因的發現將為肺腺癌治療藥物的開發提供新的重要分子靶標。