血清外泌體miR-338在老年食管癌中表達及診斷價值

馮世軍 饒鐘茗 韓冰 郭偉

(駐馬店市中心醫院 1心臟大血管外科，河南 駐馬店 463000；2胸外科)

食管癌也稱食道癌，其發病率在逐年上升〔1,2〕，因此早期發現并及時治療食管癌是降低死亡率的有效手段。臨床主要采用X線造影、脫落細胞學及內鏡技術等相結合來早期診斷食管癌，使高危人群中食管癌的檢出率大大提高，但操作復雜、檢測時間長且給患者帶來較大痛苦〔3～5〕。因此尋求理想血清標志物來早期診斷食管癌在臨床上意義重大。外泌體是大小均一的囊泡樣小體，是細胞主動向細胞外分泌所產生，其在細胞之間有運送生物活性分子的作用〔6〕。外泌體在缺氧環境下分泌增加，其攜帶的核酸(包括miRNA)和蛋白質在信號轉導作用下，在腫瘤微環境中進一步使腫瘤異質化、誘導腫瘤轉移、促進血管生成等〔7，8〕。miR-338是miRNA家族一員，王文靜等〔9〕研究發現，miR-338基因簇在胃癌組織中表達水平顯著低于癌旁組織，提示miR-338可能是抑癌基因參與胃癌的發生。目前，有關血清外泌體miR-338在食管癌中的表達水平及診斷價值研究鮮有報道。本研究對食管癌患者血清外泌體miR-338表達水平及診斷價值進行分析。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月至2019年9月于駐馬店市中心醫院就診的老年食管癌患者32例作為觀察組，男25例，女7例；年齡60～78歲，平均(68.32±8.13)歲。另選取同期在駐馬店市中心醫院治療的老年食道良性病變患者35例作為對照組，男27例，女8例；年齡60～79歲，平均(69.18±9.04)歲。診斷標準：參照中國抗癌協會食管癌專業委員會編撰的《食管癌規范化診療指南》〔10〕。納入標準：①初治患者；②未接受其他抗癌治療；③臨床資料完整患者。排除伴有其他癌癥患者。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會同意。所有受試對象簽署知情同意書。

1.2主要儀器與試劑 RT-PCR分析儀(型號7500)、分光光度計(型號UV-3672)、生物分析儀(型號Agilent2100)均購自美國ABI公司；透射電子顯微鏡(型號Tre-100bm)購自日本電子公司；Nano sight納米粒度儀(型號GH8935K)購自英國Nanosight公司；外泌體提取試劑盒ExoQuick-TM(貨號ND4672-8)、SYBR Premix ExTaq試劑盒(貨號N5643MJ)購自美國Sigma公司；PrimeScript RT reagent試劑盒(貨號ND6527J)均購自購自北京中杉金橋公司；CD9抗體(貨號GH8935K)、CD63抗體(貨號627925)、TSG101抗體(貨號M78320J)、Calnexin抗體(貨號67869NJ)均購自美國Bioworld公司；羊抗兔二抗(貨號O6721D)購自北京博奧森生物技術有限公司；TRIzol試劑(貨號MN562J2)購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司。

1.3血清外泌體的提取與鑒定 收集患者外周血，離心分離血清并置于新的EP管中，于-80℃冰箱保存待用。(1)嚴格按照ExoQuick-TM試劑盒說明書提取血清外泌體，用磷鎢酸將得到的外泌體樣品染色后，用透射電子顯微鏡觀察顆粒形態。(2)用Nano Sight納米粒度儀對外泌體顆粒濃度進行檢測，在10 000倍數下稀釋樣品，閾值為5，檢測過程中各參數保持不變。(3)采用Western印跡對外泌體表面標志蛋白CD9、CD63、TSG101、Calnexin進行檢測。

1.4實時熒光定量PCR法檢測血清外泌體miR-338水平 采用TRIzol試劑提取血清外泌體中總RNA，以分光光度計檢測miR-338濃度，用生物分析儀檢測所分離的miR-338純度，OD 260 nm/280 nm值在1.8～2.0范圍，代表提取的RNA合格。以RNA為模板，按照PrimeScript RT reagent試劑盒說明書進行逆轉錄反應得cDNA。以cDNA為模板，參照SYBR Premix ExTaq試劑盒說明書，進行熒光定量PCR，反應體系(10 μl)：cDNA模板(50 ng/μl)1.5 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μl，SYBR Green Mix 6 μl，dH2O 1.3 μl。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40個循環。以U6作為內參，以(RQ)=2-ΔΔCt方法表示血清外泌體miR-338相對表達量。miR-338、U6引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.5血清外泌體miR-338與臨床病理特征關系的方法 依據血清外泌體miR-338的表達水平結果，將觀察組患者分成高表達組17例和低表達組15例，分析血清外泌體miR-338與腫瘤分級、淋巴結狀況、臨床分期等臨床病理參數的關系。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t、χ2檢驗。繪制受試者工作特征(ROC)曲線分析血清外泌體miR-338水平對老年食管癌的診斷價值。

2 結 果

2.1血清外泌體的鑒定 Nano Sight檢測結果顯示，樣品中顆粒主要分布于35～200 nm，且分散均一，直徑呈單峰正態分布曲線，峰值約在55 nm處(圖1)。外泌體樣品經染色后于透射電鏡下觀察，圓形脂質雙層膜囊狀顆粒清晰可見，直徑約為150 nm(圖2)。Western印跡結果顯示，外泌體樣品穩定表達CD63、TSG101、CD9外泌體標志蛋白，而不含細胞成分Calnexin蛋白(圖3)。以上方法表明，純化樣品中含有大量外泌體顆粒，且具備外泌體特性。

圖1 Nano Sight檢測結果

圖2 透射電鏡觀察結果(×50 000)

圖3 Western印跡檢測結果

2.2兩組血清外泌體miR-338表達水平 與對照組比較，觀察組血清外泌體中miR-338表達水平顯著降低(0.51±0.18 vs 0.25±0.09，t=7.369，P=0.000)。

2.3老年食管癌患者血清外泌體miR-338表達水平與臨床病理參數關系 低表達組年齡≥68歲患者比例、有淋巴結轉移及臨床Ⅲ～Ⅳ分期患者比例明顯高于高表達組(P<0.05)。見表2。

表2 血清外泌體miR-338表達水平與老年食管癌患者臨床病例參數關系〔n(%)〕

2.4血清外泌體miR-338表達水平對老年食管癌診斷價值 ROC曲線結果顯示，血清外泌體miR-338水平預測老年食管癌的AUC為0.918(95%CI：0.863～0.974)，截斷值為0.360 pg/ml，靈敏度和特異度分別為84.5%、86.3%。見圖4。

圖4 血清外泌體miR-338表達水平對老年食管癌診斷ROC曲線

3 討 論

食管癌有較高發病率及致死率，由于其早期癥狀不明顯，因此患者在確診時往往已是中晚期，給患者家庭和生活方面帶來嚴重影響〔11,12〕。因此如何早期診斷并及時治療食管癌，在臨床尤為重要。

外泌體是從細胞中釋放出的最小的細胞外囊泡之一，具有脂質雙分子層結構。細胞內內陷的溶酶體微粒形成多囊泡體，經刺激后，多囊泡體與質膜融合進而向胞外釋放外泌體〔13,14〕。外泌體可以包裹、傳遞miRNA、DNA及蛋白等多種重要物質，與腫瘤的生長和轉移密切相關，腫瘤周圍組織細胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細胞的能力，且外泌體的采集不受血液數量及存儲時間的限制，具有血清學研究不可比擬的優勢〔15〕。Liu等〔16〕研究發現，外泌體運送的miR-93-5p基因能夠促進食管癌細胞增殖，并影響細胞周期蛋白D1的表達。本研究成功提取并鑒定血清外泌體。成熟miRNA是長度為20～23個核苷酸(nt)的單鏈RNA分子，是基因表達的重要調節劑，通常會降低mRNA穩定性，包括介導腫瘤發生過程基因的mRNA。miRNA靶向主要是通過miRNA 5′端(“種子”區域)與mRNA編碼區和非翻譯區(UTR)內的位點之間的特定堿基配對相互作用實現的〔17〕。miRNA通過轉錄后抑制基因表達來調節細胞生長和代謝〔18〕。Yan等〔19〕研究發現，miR-338在食管鱗狀細胞癌組織中的表達比相應癌旁組織顯著降低，是食管鱗狀細胞癌的抑癌基因。但目前有關血清外泌體miR-338在老年食管癌中的臨床意義鮮有報道。本研究提示血清外泌體miR-338異常表達與食管癌的發生發展密切相關。血清外泌體miR-338表達水平與患者年齡、淋巴結轉移、臨床分期有相關性。血清外泌體miR-338水平對食管癌有較高診斷價值。

綜上，血清外泌體miR-338有望成為臨床上診斷老年食管癌的新型生物標志物。本研究存在一定不足，樣本量較少，后期應加大樣本量對血清外泌體miR-338在食管癌中的具體作用機制作進一步研究。