LncRNA MALAT1在2型糖尿病患者中的表達(dá)及臨床意義

楊大偉 黃慶 周連吉 歐麗娜 吳標(biāo)良

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西 百色 533000)

2型糖尿病(T2DM)發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明確〔1～4〕。近年來隨著人類基因組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，長鏈非編碼RNA(LncRNA)逐漸進(jìn)入人們的視野并引起廣大科研人員的關(guān)注。越來越多的研究表明，LncRNA正在成為糖尿病發(fā)病環(huán)節(jié)中的積極參與者〔5,6〕。LncRNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MALAT)1是一種經(jīng)典的，廣為研究者研究的LncRNA。MALAT1廣泛表達(dá)于多種組織中，最初的研究主要集中于它與腫瘤的關(guān)系方面〔7,8〕。但后來的研究表明，LncRNA MALAT1與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥之間的關(guān)系密切〔9〕。中國的一項(xiàng)研究中共收集了50例患有妊娠糖尿病的患者及47名健康孕婦，發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病患者血清中LncRNA MALAT1水平升高〔10〕。Liu等〔11〕在研究中使用sh-MALAT1沉默了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的MALAT1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MALAT1沉默后，抵抗素(resistin),血管緊張素(Ang)Ⅱ,腫瘤壞死因子(TNF)-α,白細(xì)胞介素(IL)-6,可溶性細(xì)胞間黏附分子(sICAM)-1表達(dá)水平下降，胰島素抵抗減輕，同時(shí)在小鼠模型中，觀察到運(yùn)動可以下調(diào)MALAT1水平，減少了胰島素抵抗的發(fā)生。Yan等〔12〕在研究中發(fā)現(xiàn)高血糖能夠引起視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中MALAT1 表達(dá)增加；沉默 MALAT1表達(dá)后，能夠顯著緩解糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管化、血管的滲漏和視網(wǎng)膜炎癥。在糖尿病大鼠心肌細(xì)胞中，LncRNA MALAT1的下調(diào)，可以保護(hù)心肌細(xì)胞，并改善心功能〔13〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)中高表達(dá)，可以使β-catenin發(fā)生易位到細(xì)胞核上，同時(shí)會增強(qiáng)絲氨酸/精氨酸剪接因子1的表達(dá)，從而引起腎臟足細(xì)胞的損傷。而早期沉默MALAT1后足細(xì)胞功能得到了部分恢復(fù)〔14〕。

盡管以上研究說明了LncRNA MALAT1與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但目前仍缺乏LncRNA MALAT1在T2DM人群表達(dá)情況的研究。本研究擬探討 LncRNA MALAT1 在T2DM人群中的表達(dá)及臨床意義。

1 材料和方法

1.1一般資料 共收集2017年1～7月在廣西壯族自治區(qū)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院部就診的患者94例，其中糖尿病患者69例，同時(shí)選擇正常健康體檢者25例作為對照組。糖尿病組男44例，女25例，平均年齡(55.54±11.93)歲；體重指數(shù)(BMI)為(24.03±11.17)kg/m2，有吸煙史11例；對照組男14例，女11例，平均年齡(52.12±12.82)歲，BMI為(24.63±4.80)kg/m2，有吸煙史5例。兩組一般資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。糖尿病組入組條件：①年齡35～65歲。②排除腫瘤、感染、傳染性疾病等其他重大疾病。③符合2017年中國T2DM防治指南中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔15〕。對照組入組條件符合上述1、2條，但經(jīng)糖耐量實(shí)驗(yàn)不符合糖尿病診斷者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者均知情同意。

1.2一般資料與臨床指標(biāo)收集 所有患者于入院時(shí)進(jìn)行體格檢查，收集體重、身高、血壓、心率等基本資料，并計(jì)算BMI。空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血脂等生化指標(biāo)使用邁瑞B(yǎng)S-2000M(邁瑞，中國深圳)全自動生化儀進(jìn)行檢測，胰島素、皮質(zhì)醇等使用全自動化學(xué)發(fā)光測定儀A2000(安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國鄭州)進(jìn)行檢測，所有檢測由右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)受過專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員進(jìn)行。口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)于次日8點(diǎn)在空腹?fàn)顟B(tài)下開始進(jìn)行，將75 g無水葡萄糖溶入200～300 ml溫開水中，于5 min內(nèi)飲完，隨即開始采血，并立即送檢標(biāo)本。使用胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)來評估患者胰島素抵抗的情況，計(jì)算公式為HOMA-IR=FPG×空腹胰島素/22.5。所有單位換算為國際標(biāo)準(zhǔn)單位。

1.3RT-PCR 所有患者于清晨8時(shí)開始采血，抽取5 ml靜脈血，加入9 ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后于4℃下2 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行沖洗，提取好的白細(xì)胞于-80℃下進(jìn)行保存。使用Trizol 試劑盒(普飛，中國上海)抽提白細(xì)胞中的總RNA，然后使用Promega M-MLV 試劑盒(銳博生物，中國廣州)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物購自中國銳博生物有限責(zé)任公司。以上操作均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

PCR分析使用SYBR綠色試劑盒(天根生物，北京)。PCR條件：95℃ 15 min；(95℃ 10 s；60℃ 20 s )× 40 個循環(huán)。PCR使用溶解曲線評估。每個樣本設(shè)置3個平行樣，取平均值。以 2-ΔΔCt值表示LncRNA MALAT1的表達(dá)水平，ΔΔCt =(CTMALAT1-CTGADPH)DM-(CTMALAT1-CTGADPH)con。引物序列：MALAT1：上游5′-CAGACCACCACAGGTTTACAG-3′、下游5′-AGACCATCCCAAAATGCTTCA-3′，GADPH：上游 5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′、下游：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析、二元Logistic 回歸模型分析。受試者工作特征(ROC)曲線及曲線下面積(AUC)用于評價(jià)診斷指標(biāo)的診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床資料對比 糖尿病組 FPG、超氧化物歧化酶(SOD)、HbA1C均顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

2.2LncRNA MALAT1在兩組表達(dá) 糖尿病組血清白細(xì)胞中LncRNA MALAT1表達(dá)水平(2.40±1.01)較對照組(1.04±0.28)明顯升高(t=-6.587,P<0.001)。

2.3二元回歸分析LncRNA MALAT1與T2DM發(fā)病之間的關(guān)系 使用二元Logistic回歸分析對T2DM患者的發(fā)病的影響因素進(jìn)行評估。結(jié)果顯示LncRNA MALAT1(P<0.001，OR=11.667，95%CI：3.181～42.792)及SOD(P=0.018，OR=0.958，95%CI：0.925～0.993)是T2DM發(fā)病的影響因素。

2.4LncRNA MALAT1表達(dá)與OGTT實(shí)驗(yàn)中胰島素分泌之間的相關(guān)分析 LncRNA MALAT1表達(dá)與SOD(r=-0.26，P=0.01)、HbA1c(r=0.35,P=0.001)、OGTT實(shí)驗(yàn)中胰島素分泌(60 min)(r=0.35,P<0.001)及血糖(60、120、180 min)(r=0.35、0.40、0.39，均P<0.001)存在相關(guān)性，其余指標(biāo)未見明顯相關(guān)性。

2.5ROC曲線分析LncRNA MALAT1對T2DM的預(yù)測意義 AUC為0.807(95%CI： 0.708～0.906,P<0.001)，敏感度為 78.3%，特異度為 84.0%。見圖1。可知，LncRNA MALAT1的表達(dá)對T2DM有一定的預(yù)測價(jià)值。

圖1 ROC分析LncRNA MALAT1作為診斷T2DM血清標(biāo)志物的生物潛能

3 討 論

LncRNA被認(rèn)為與細(xì)胞的分化、增殖、代謝及多種生命活動相關(guān)，參與許多疾病的發(fā)生與發(fā)展〔16～19〕。目前有研究指出多種LncRNA與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有著十分密切的關(guān)系，包括H19〔20〕、MEG3〔21〕、uc.322〔22〕等。

本研究與Zhang等〔10〕研究結(jié)果是一致的，在妊娠期糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1較正常孕婦升高。同時(shí)本研究說明LncRNA MALAT1對糖尿病患者的血糖控制是有影響的，同時(shí)也表明LncRNA MALAT1表達(dá)升高會導(dǎo)致糖尿病患者的血糖控制差而加速并發(fā)癥的發(fā)生。這與近年來的研究指明LncRNA MALAT1參與糖尿病腎病〔23〕、糖尿病視網(wǎng)膜病變〔24〕的發(fā)病相符合。

本研究結(jié)果表明了LncRNA MALAT1可能影響了機(jī)體對高血糖的反饋調(diào)節(jié)。機(jī)體對于高血糖的正確反饋是分泌更多的胰島素以降低過高的血糖，LncRNA MALAT1可能通過抑制胰島素對高血糖的主動分泌而影響了血糖的升高。在Feng等〔25〕的研究中，LncRNA MALAT1可以通過下調(diào)miR124的表達(dá)抑制CDK4/E2F1信號通路來抑制乳腺癌的增殖，而CDK4/E2F1通路是影響胰島素分泌的重要通路。這是否驗(yàn)證了我們的猜測，當(dāng)然，這需要更進(jìn)一步的研究去證明它們之間的聯(lián)系。

SOD是人體內(nèi)最重要的抗氧化劑，而氧化應(yīng)激目前已被認(rèn)為是糖尿病發(fā)病及諸多并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要原因〔20〕。Gong等〔26〕研究顯示，LncRNA MALAT1在糖尿病性白內(nèi)障患者中同樣與SOD的水平呈負(fù)性相關(guān)，并推測其可能通過p38MAPK信號通路來誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。Chen等〔27〕的研究發(fā)現(xiàn)在下調(diào)了LncRNA MALAT1的大鼠中，活性氧(ROS)明顯下降。這些都表明LncRNA MALAT1可以誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。但是，LncRNA MALAT1誘導(dǎo)氧化應(yīng)激參與T2DM發(fā)病的具體分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

綜上，LncRNA MALAT1在2型糖尿病患者中高表達(dá)，可作為其診斷的潛在標(biāo)志物，其可能的機(jī)制不明，但或與氧化應(yīng)激有關(guān)。