基于水凝膠3D生物打印在組織工程中的應用

王超威，張銘，閆立論，夏培斌，劉念念，李丹杰，劉志遠，程杰，崔景強

(河南省醫用高分子材料技術與應用重點實驗室 河南駝人醫療器械集團有限公司，河南 長垣 453000)

3D打印又稱增材制造技術，是一種以計算機為輔助設計工具，通過對模型切片處理，以逐層疊加的方式快速呈現目標的技術，3D打印以其個性化定制、快速成型的優勢在航空航天、汽車零部件、生物醫學、教育教學等方面起到了重要的作用。3D生物打印作為3D打印的一個分支，從廣義上來說，是直接為生物醫療行業服務的3D打印，而從狹義上來說，3D生物打印是以裝載細胞的生物墨水為打印材料進行具有生物學活性的組織器官支架，芯片等的3D打印技術。當前結合細胞進行3D生物打印逐步成為研究的熱點，在組織工程再生、藥物篩選、疾病治療等方面具有良好的預期應用及前景[1]。

在3D生物打印中，水凝膠以其良好的生物相容性及高的含水率，可以模擬細胞外基質（ECM）及調節細胞命運的特點，在組織工程中得到了廣泛的應用，作為一種高度水合的三維聚合物，水凝膠可以促進三維環境下的基質重塑、細胞遷移和細胞黏附，滿足了功能組織正常發育所必需的條件，本文將從水凝膠3D生物打印技術、3D生物打印水凝膠、水凝膠3D生物打印在組織工程中應用及其發展趨勢方面進行闡述。

1 水凝膠3D生物打印技術

水凝膠材料因含有大量的水分，其打印需要溫和的條件，應用于水凝膠3D生物打印的技術主要有三種工作原理，包括基于材料及黏合劑的噴墨生物打印系統、基于光聚合生物打印系統、基于擠壓式的噴嘴生物打印系統，其中基于光聚合的打印方式又包括立體光刻、雙光子聚合及激光誘導轉移，各種工作原理的3D打印技術在水凝膠方面都有廣泛的應用。

1.1 噴墨生物打印系統

噴墨打印系統作為一種非接觸式的成型打印技術，是定制聚合物沉積領域的關鍵所在。通過從計算機上獲取數字信息，將生物墨水及黏結劑等以液滴的形式噴射至指定的位置，從而成型目標模型樣品[圖1(a)][2]。噴墨打印一般分為按需噴墨系統和連續噴墨系統，在連續噴墨系統中，連續的墨水在壓力下從打印頭中流出，產生噴射，然后在電信號控制運動方向的作用下，射流可以分解成小液滴。在液滴按需噴墨系統中，驅動器可以產生脈沖，并通過壓電或熱磁頭將具有預定墨量的單個液滴噴射出來。噴墨打印機能夠高保真地將多種材料打印到相關尺寸的結構中，分辨率為50～500 μm，適合制造復雜的支架，已被用于各種組織工程支架等生物材料的打印[3]。

1.2 光聚合生物打印系統

基于光聚合生物打印技術是以可光交聯的的水凝膠材料為基體，以特定波長的光引發特定或整體位置水凝膠發生交聯聚合從而構筑目標組織工程支架、模型等的一種打印方式。目前光聚合進行生物打印的方式主要包括立體光刻技術、雙光子聚合技術及激光誘導轉移技術。

立體光刻（SLA）技術是第一種商業化的3D打印技術，光固化的水凝膠或其他聚合物溶液經紫外或激光的投影光源照射，通過逐層的固化疊加形成所預先設定的模型[4]。雙光子聚合技術是采用近紅外飛秒脈沖激光作為光源，制備分辨率高的三維結構模型，該技術具有良好的空間選擇性，但雙光子吸收要求特定的物質和極高的能量密度，只有當光強達到一定值時，才會出現明顯的雙光子吸收效應[5]。激光誘導轉移技術[圖2(b)]是激光透明供體被涂上一層固體、液體或黏貼層，當激光脈沖穿過供體載玻片并被涂層吸收，當入射能量超過某一特定閾值時，生物墨水材料將從涂層中噴射出來，并別接收板接收，從而形成復雜的高分辨率2D和3D圖案(10～100 μm分辨率)[6]。

1.3 擠壓式生物打印系統

基于擠壓式的水凝膠3D生物打印[圖1(c)]是制備負載細胞結構研究和應用最廣泛的方法，該技術是將生物墨水放置在一次性醫用塑料注射器中，然后通過氣動或機械(活塞或旋轉螺桿)將墨水按預定軌跡排布于基板上從而逐層呈現目標模型，該技術非常適合于支架制造和水凝膠加工[7]，分辨率在μm到cm范圍內。

2 3D生物打印水凝膠

ECM是一個以細胞為中心的復雜微環境，主要由蛋白質、糖胺聚糖和其他可溶性分子共同作用而組成的。ECM可以為細胞微環境提供動態的生化和生理信號，這是細胞生理和命運的關鍵決定因素[8]。水凝膠的結構與ECM較為相似，通過模擬ECM，水凝膠不僅能夠為細胞駐留提供結構支持，還能夠提供各種預定義的生化信號（細胞因子、生長因子、細胞黏附肽等）和生理信號（結構、剛度、降解等）來調節細胞命運[9]。考慮到水凝膠材料的可打印性能，用于3D生物打印的水凝膠材料需滿足首要的兩個因素是流變性能和交聯機制，其中流變性能包括黏度、剪切變稀、屈服應力等，而交聯機制指打印的水凝膠需能夠進行物理、化學或二者結合的交聯。目前用于3D生物打印的水凝膠主要包括單組分水凝膠、互穿網絡水凝膠、超分子水凝膠、納米復合水凝膠及復合水凝膠。

2.1 單組分水凝膠

單組分水凝膠是指單一的天然水凝膠或改性水凝膠在引發劑等的存在下自身形成水凝膠，該類水凝膠已被廣泛的應用于3D生物打印中，較為典型的為基于海藻酸鈉、明膠及膠原的水凝膠。Schuster等[10]利用聚乙二醇對明膠衍生物進行改性制備一種光固化的骨替代材料，該材料具有可以調節的機械性能及良好的生物學性能。Rhee等[11]開發了一種高密度膠原水凝膠的3D生物打印方法，并對打印結構的幾何保真度、細胞活力和機械性能進行表征。

2.2 互穿網絡水凝膠

互穿網絡（ⅠPN）水凝膠是指兩種及兩種以上的水凝膠組分通過網絡互穿的形式纏繞在一起而形成的一種獨特的水凝膠共混物，該共混物可以有效的實現兩種或多種水凝膠的性能互補，同時ⅠPN的特殊細胞狀結構、界面互穿、雙相連續等形態特征，又使得它們在性能或功能上產生特殊的協同作用，防止相分離，極大地提高了水凝膠的機械強度及可響應性。Bakarich[12]基于海藻酸鹽和丙烯酰胺的離子共價糾纏水凝膠，該水凝膠可以進行擠壓印刷和原位光聚合，具有良好的可打印性能。Lopez-Marcial等[13]通過海藻酸鹽和瓊脂糖的結合，制備了一種海藻酸瓊脂糖ⅠPN水凝膠，以5%（W/V）（瓊脂糖與海藻酸鹽的比例為3:2）制備的海藻酸瓊脂糖復合材料在28 d的的細胞培養中，細胞的存活率達到了70%。Lim[14]等在甲基丙烯酰化明膠（GelMA）中加入[ω(型膠原)=0.6%)改變了GelMA的流變行為，更好地控制了打印保真度。

2.3 超分子水凝膠

超分子水凝膠（SHGs）是由低分子量分子、低聚物或聚合物組成的網絡，這些聚合物通過非共價相互作用在幾分鐘到幾小時內自組裝成更大的纖維狀或某種有序的上層結構，然后通過共價或非共價作用交聯，糾纏，從而形成的一種自組裝水凝膠。該類基于主客體相互作用的水凝膠可用于打印梯度生物結構或通過分子識別的方式自組裝為更復雜的水凝膠生物結構，具有可控調節的物理、化學及生物學特性。Li等[15]人開發了一種基于DNA水凝膠為生物墨水的快速原位多層生物打印方法，該DNA生物墨水包含多肽共軛和DNA互補鏈接器兩種水凝膠，具有良好的自愈合能力和機械強度，并對蛋白酶和核酸酶有響應。

2.4 納米復合水凝膠

納米復合水凝膠是一種結合納米粒子添加的水凝膠，水凝膠中納米顆粒的加入可以改變水凝膠基體的物理、化學及生物學性能，可以賦予水凝膠更良好的打印性能、機械性能、熱穩定性能等。Nadernezhad等[16]通過在瓊脂糖生物墨水中添加納米硅酸鹽，改善了瓊脂糖生物墨水流變、凝膠化行為及可打印性能，并可提高被封裝細胞的代謝活性。Zhu等[17]將金納米棒嵌入GelMA中而制備一種納米復合生物墨水用于心臟組織的3D打印，改善了細胞間的耦合，并促進生物打印結構間的同步收縮并利于細胞更好的黏附。

2.5 復合水凝膠

復合水凝膠是由多種水凝膠相互作用形成的混合水凝膠，該類水凝膠可以高分辨率高精度的再現復雜的ECM微結構，多材料多細胞的結合可以打印出具有多種形態、結構、力學性能和多功能成分的復雜三維生物結構，建立具有仿生結構和功能特性的多重生物結構。Miri[18]等開發了一種基于SLA技術的生物打印平臺，用于非均相水凝膠結構的多材料制備，利用聚乙二醇二丙烯酸酯和GelMA制備了水凝膠結構證明該平臺的多材料打印能力（如圖2）。Rutz等[19]利用凝膠劑（明膠、GelMA、四臂聚乙二醇胺）和雙反應活性位點處于尾端的聚乙二醇（PEGX）化學交聯劑開發了一種生物墨水，PEGX交聯可以提供可定制的黏度和生物降解性，而不危及細胞活性。

3 水凝膠3D生物打印在組織工程中的應用

隨著水凝膠3D生物打印技術的發展及水凝膠材料的不斷豐富，以水凝膠為基體進行個性化組織器官模型、芯片等的打印正在快速的發展。基于水凝膠的3D生物打印在組織工程的應用上主要包括三個方面：其一是組織器官的再生，其二為體外組織器官模型的構建用于輔助藥物開發及篩選等，其三為病變組織或器官的體外還原用于輔助治療。

3.1 組織器官的再生

組織器官的再生概念自1993年Robert Langer[20]提出后，經過近30年的發展已經逐步滲透到組織工程的各個環節，目前水凝膠3D生物打印組織器官的再生在骨修復、軟骨再生、脊髓損傷與修復、皮膚再生、血管再生等多方面得到了應用[5,21]。Batzayaa 等[22]基于擠壓式3D生物打印設計了一種血管化骨組織結構，以模擬整個骨結構，在GelMA水凝膠中具有不同成分的圓柱形細胞載體水凝膠共培養血源性人臍靜脈內皮細胞和骨髓源性人間充質干細胞，在構建物的一側使用較高機械強度以及使用封裝的二氧化硅納米血小板來誘導成骨，并用化學偶聯的血管內皮生長因子來刺激血管生成，7 d后，可灌注血管通道在生物打印結構出現，并且打印的結構件在體外可以穩定21 d。Kesti等[23]開發了一種由海藻酸鹽和結冷膠組成新型軟骨特異性生物墨水，通過共擠出的方式制備的復雜軟骨結構件具有良好的生物相容性。Koffler等[24]通過微尺度連續投影打印（μCPP）制造復雜的中樞神經系統結構，用于脊髓再生，μCPP可在1.6 s內打印適合嚙齒動物脊髓尺寸的3D仿生水凝膠支架，該水凝膠支架在嚙齒類動物完全脊髓損傷的體內部位形成新的神經傳遞。Koch等[25]通過激光3D生物打印技術在膠原水凝膠中呈現了成纖維細胞和角質形成細胞的三維空間排列，制造多細胞3D皮膚移植物。Kim等[26]提出了一種新的3D細胞打印平臺，以打印復雜的皮膚解剖結構，該平臺可以設計可灌注的皮膚血管化3D人體皮膚的打印，由表皮、真皮和下皮層組成的全層皮膚模型的成功打印顯示了原生人類皮膚再現的可能。

3.2 體外組織/器官模型的構建

3D生物打印與組織工程及再生醫學的緊密結合，于體外構建組織器官模型及芯片平臺，在疾病救治、癌癥研究、藥物開發及篩選等方面的具有廣闊的前景。3D生物打印制備的組織器官芯片可以通過對組分的精確控制來模擬組織或器官復雜的基質環境，同時能夠在組織工程結構支架中精確定制細胞、ECM、生物材料和生長因子的位置，為不同的生物醫學應用創建仿生組織和器官模型。另外，3D生物打印與微流控技術相結合，可以創建復雜的流通通道/腔室和具有3D異質結構、細胞放置和組織特異性的功能性生物結構以更接近真實的組織或器官。Colosi等[27]利用海藻酸鹽和GelMA的混合物開發一種低黏度的生物墨水，結合微流控平臺組成精確和控制沉積的微流體系統，該系統可以促進細胞在生物結構體內部的傳播和遷移，基于此創建了非均勻3D體外組織模型，以模擬原生組織，可用于再生醫學或藥物開發。Cao等[28]制備了一種由3D生物打印中空血管和淋巴管組成的改進腫瘤芯片模型，通過3D生物打印血管和淋巴管的不同組合，顯示了生物分子或抗癌藥物的不同擴散譜，預示著這種體外腫瘤模型可以模擬藥物在腫瘤微環境中的轉運，從而提高抗癌藥物的篩選準確性。

3.3 術前準備

隨著個性化、精準化醫療的提出與深入，3D打印在輔助醫生進行術前準備方面已逐漸被應用。通過CT掃描，定位病變部位，3D打印患者病變結構來開發針對患者的治療方案，可以協助醫生在手術前模擬所有復雜的手術過程，預測可能的手術中事故或并發癥[29]。利用水凝膠進行3D生物打印，可以創建與原生活體相似的血管網絡軟組織和器官模型，3D打印的堅硬水凝膠甚至可以用來制造硬組織，如軟骨、肌腱和韌帶。機械性能和功能特征更接近人體組織結構的水凝膠3D模型的應用較普通模型更有利于手術的成功。

4 水凝膠3D生物打印的趨勢

水凝膠3D生物打印的發展主要集中在新材料的開發及應用方面的拓展，當前水凝膠的種類還較少，而且功能比較單一，新型水凝膠材料的開發的是重中之重。新材料的應用也會拓寬水凝膠3D生物打印的應用領域，與微電子、人機交互方面的結合正在被關注。

4.1 生物3D水凝膠材料的開發

伴隨著人工智能的快速發展，智能型3D生物打印水凝膠的開發已成為3D打印發展的趨勢。智能型水凝膠通常指在光、電、熱、滲透壓等外界刺激下，水凝膠可以在形式及功能上發生自我轉換，該類水凝膠通常也被稱為4D水凝膠[5]。隨著人類對組織發育和愈合的生物學過程理解擴展，刺激響應性的信息將被整合到組織支架中，使特定的信號在適當的空間和時間方式傳遞，如何合理的可控設計水凝膠的結構、反應的方式、細胞定向的表達行為將推動3D生物打印水凝膠的發展。

4.2 水凝膠3D生物打印的應用

水凝膠材料及3D打印技術的發展，使水凝膠材料的應用在不斷的延伸，當前水凝膠3D生物打印在可穿戴電子、仿生軟機器人等方面受到了大的關注。結合水凝膠材料良好的可拉伸性、生物相容性、離子導電性、與生物組織的相似性及3D生物打印的個性化精確定制特性，水凝劑3D生物打印可以創建具有復雜結構的可定制可穿戴柔性電子設備（如圖3）[5,30]。基于機械強度和刺激響應性水凝膠材料的設計和開發可以有效幫助基于水凝膠的仿生軟機器人技術的快速發展，3D打印可以定制設計并一步制備具有復雜結構的高分辨率軟機器人，這種仿生機器人在藥物輸送、藥物篩選、癌癥治療等方面將發揮巨大的作用。Bashir等[31]開發了一種非對稱物理設計的水凝膠生物機器人，由工程骨骼肌提供動力來移動，電刺激能夠觸發骨骼肌內的C2C12細胞收縮和水凝膠生物機器人的運動，最高速度超過每分鐘1.5個體長(～156 μm·s-1)，這種生物機器人可以在系統中集成細胞組件，從而實現了廣泛的生物醫學應用。

5 總結及展望

水凝膠以其良好的仿生性能在3D生物打印組織工程中的應用越來越廣泛，本文從當前水凝膠3D生物打印的常用技術、用于組織工程方面水凝膠的材料以及組織工程中水凝膠3D生物打印的應用方面進行了闡述，同時介紹了水凝膠3D生物打印在材料開發、應用拓展等方面的發展需求。隨著國家個性化醫療、精準化醫療不斷深入，水凝膠3D生物打印將會起到越來越重要的作用。