L02肝脂肪變性細胞膜快速篩選大黃調血脂活性成分

武曉玉，段文達，夏鵬飛，王玉霞，邊惠琴，趙 磊*

? 藥理與臨床 ?

L02肝脂肪變性細胞膜快速篩選大黃調血脂活性成分

武曉玉1, 2, 3，段文達1，夏鵬飛1, 2, 3，王玉霞1，邊惠琴1，趙 磊1, 2, 3*

1. 甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省高校中（藏）藥化學與質量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省道地藥材質量標準化研究與推廣工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

構建L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜耦合脂肪變性模型，并將其應用于大黃調血脂活性成分的快速篩選。利用L02肝脂肪變性細胞膜作為固定相選擇性地吸附大黃30%乙醇提取液中的活性成分，采用高效液相色譜（HPLC）測定吸附前后的化學成分；根據對照品的保留時間及紫外光譜信息，對比鑒定各親和活性成分；并將篩選出的活性成分進一步作用于L02肝脂肪變性細胞模型，驗證其調血脂作用。從大黃30%乙醇提取液中共篩選出11種活性成分，分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和6種未知成分。蘆薈大黃素等蒽醌苷元能夠顯著降低L02肝脂肪變性細胞中三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量（＜0.01），且可減少L02肝脂肪變性細胞中的脂肪粒。建立的L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜耦合脂肪變性模型可用于快速篩選中藥復雜體系中的活性成分，為進一步深入探究大黃調血脂活性成分群奠定了基礎。

大黃；L02肝脂肪變性細胞；細胞膜固相色譜；活性成分；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚

大黃為甘肅道地藥材，其藥用歷史悠久、資源豐富，為臨床常用中藥之一。《神農本草經》記載其“蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調中化食，安和五臟”[1]；臨床主要用于大便干結、濕熱泄瀉、濕熱黃疸、熱邪血熱、火眼充血、咽喉腫脹、牙齦炎痛、皮感疼痛、表皮燙傷、瘀血諸證[2]。現代藥理學研究表明，大黃具有瀉下、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、調血脂等作用[3]。目前大黃調血脂的研究主要旨在證明其調血脂能力[4-6]，其具體調血脂活性成分尚不明確。本課題組前期利用高血脂大鼠模型對大黃水提液、30%乙醇提取液、醋酸乙酯提取液進行篩選，通過測定血清中三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，對大黃不同部位調血脂效果進行綜合評價，發現大黃30%乙醇提取液是其調血脂有效部位[7]。

細胞膜固相色譜法的原理為直接用生物靶點富集的細胞膜，選擇性地結合中藥提取液中的活性成分，洗去未結合成分后，再用解離液將細胞膜上的成分解離下來，利用色譜技術分離鑒定效應物質。細胞膜固相色譜具有快速、方便等優點，適用于中藥復雜成分的高通量篩選[8-13]。為深入探究大黃調血脂活性成分群，本研究利用L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜快速篩選大黃調血脂活性成分，并將其活性成分進一步作用于L02肝脂肪變性細胞模型，以驗證其調血脂效果，為探明大黃調血脂的藥效物質基礎提供參考。

1 材料

1.1 細胞株

人L02肝細胞購自普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥材

大黃購自甘肅隴脈藥材有限公司，經甘肅中醫藥大學藥學院林麗高級實驗師鑒定為掌葉大黃L.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

PBS溶液（批號AQ29629583）、青鏈霉素混合液（批號20201116）、胰酶（批號20210629）、RPMI 1640培養液（批號AG29643109）、胎牛血清（批號21040702）、二甲基亞砜（DMSO，批號1121E0326）、Tris-HCl溶液（1 mol/L，批號20200821）、飽和油紅O（批號20210616）、蘇木素（批號21057999）、高效RIPA細胞裂解液（批號20200703）、油酸（批號SLBR187V）、Na＋, K＋-ATP酶活力測定試劑盒（批號20200629）、BCA蛋白定量試劑盒（批號20201022）、CCK-8試劑盒（批號PF724）購自北京索萊寶科技有限公司；TG測定試劑盒（批號20201118）、TC測定試劑盒（批號20201213）購自南京建成生物工程研究所；對照品蘆薈大黃素（批號18121801）、大黃酸（批號20010901）、大黃素（批號20022605）、大黃酚（批號20011601）、大黃素甲醚（批號20110101）購自成都克洛瑪生物科技有限公司，質量分數≥98%；甲醇、乙腈（色譜純）購自德國Merck公司；超純水由Milli-Q系統制備；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

Waters Allince高效液相色譜儀（HPLC，美國Waters公司）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；MCO-18AIC型CO2細胞培養箱（日本三洋株式會社）；高速冷凍離心機（美國Beckman Coulter公司）；JY92-ⅡDN型細胞破碎儀、XB-20型雪花制冰機（寧波新芝科技股份有限公司）；IMARK型多功能酶標儀（美國Bio-Rad公司）；AUTO X4全自動細胞熒光計數分析儀（美國Cellometer公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

L02細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。實驗所用細胞代數為15～35代，均處于對數生長期。

2.2 L02肝脂肪變性細胞模型的建立[14]

采用不同濃度油酸刺激L02細胞，建立L02肝脂肪變性細胞模型；以細胞存活率及細胞內TG、TC含量評價造模是否成功。

2.2.1 細胞存活率的測定 取對數生長期L02細胞，以1×105/cm2接種于96孔板中，每孔100 μL，貼壁生長24 h。將細胞板分為加入培養基的正常組和加入油酸（0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L）的模型組及無細胞的空白組，培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續孵育1.5 h后終止培養，室溫置于搖床10 min，采用酶標儀測定450 nm處各孔的吸光度（）值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(模型－空白)/(正常－空白)

2.2.2 細胞內TG、TC含量的測定 取對數生長期L02細胞，以2×105/cm2接種于6孔板，每孔1 mL，待貼壁后分為加入培養基的正常組和加入油酸（0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L）的模型組，培養24 h，吸去培養基，PBS溶液洗滌2次，加入350 μL細胞裂解液，低溫下收集各組細胞，按試劑盒說明書測定細胞內TG及TC含量。

2.3 L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜的制備[15-16]

取造模后的L02細胞，用1 mL PBS溶液洗滌2次，棄去PBS溶液，加入1 mL 0.25%胰酶消化4 min，輕輕吹打，鏡下觀察細胞全部脫落，加入1 mL PBS溶液終止消化，4 ℃、160×離心10 min，棄去胰酶，保留細胞沉淀。細胞沉淀加入5 mL PBS溶液，輕輕吹打均勻，4 ℃、160×離心10 min，洗滌2次。細胞在50 mmol/L Tris-HCL溶液中4 ℃條件下溶脹30 min，在破碎功率720 W、破碎時間2 s、冷卻間隔2 s的冰浴條件下，破碎3 min。取細胞碎片混懸液，4 ℃、1000×離心10 min，保留上清液，棄去沉淀。取上清液，4 ℃、12 000×離心20 min，棄去上清液，保留細胞膜沉淀。平行制備3份，編號為B1～B3，按試劑盒說明書測定細胞膜蛋白含量及Na＋, K＋-ATP酶活力。

2.4 HPLC測定方法的建立[17]

2.4.1 色譜條件 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～20% B；10～15 min，20% B；15～30 min，20%～30% B；30～50 min，30%～50% B；50～60 min，50%～85% B；60～65 min，85%～100% B；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用適量DMSO溶解，甲醇定容至刻度，即得對照品儲備液。依次稀釋成質量濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μg/mL的對照品溶液，0.22 μm濾膜濾過，備用。

2.4.3 供試品溶液的制備 稱取大黃粉末（過4號篩）50 g，加入30%乙醇1 L，加熱回流提取2次，減壓濃縮至稠膏，40 ℃真空干燥。使用時，配制成質量濃度為1 mg/mL溶液。

2.4.4 線性關系的考察 取“2.4.2”項下的混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，以各成分質量濃度為橫坐標（），色譜峰峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線，得回歸方程，結果見表1。

表1 線性關系考察結果

Table 1 Results of linear relationship investigation

成分回歸方程線性范圍/(μg·mL?1)R2 蘆薈大黃素y＝20.540 x－10.0931.28～164.000.999 8 大黃酸y＝16.252 x＋15.0141.25～160.000.999 7 大黃素y＝14.679 x－17.7351.28～164.000.999 8 大黃酚y＝18.250 x－3.7031.28～162.001.000 0 大黃素甲醚y＝7.468 x＋24.8131.41～180.000.999 7

2.4.5 方法學考察

（1）精密度試驗：取供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件重復測定6次，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質量分數的RSD值，結果見表2。

（2）穩定性試驗：取供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h測定，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚量分數的RSD值，結果見表2。

表2 方法學考察結果

Table 2 Results of methodological investigation

成分RSD/% 精密度穩定性重復性 蘆薈大黃素0.961.960.95 大黃酸0.292.910.30 大黃素1.361.361.28 大黃酚2.822.292.72 大黃素甲醚2.632.362.14

（3）重復性試驗：精密稱取大黃粉末6份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚量分數RSD值，結果見表2。

由表2可知，方法學考察RSD值均小于3%，表明儀器的精密性良好，供試品溶液在24 h內穩定性良好，方法的重復性良好。

（4）加樣回收試驗：取已測定大黃粉末9份，精密稱定，根據各指標成分質量分數的80%、100%、120%分別加入相應對照品，按“2.4.3”項下方法制備，“2.4.1”項下色譜條件測定，結果顯示，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均回收率分別為96.89%、97.29%、95.66%、95.94%、96.07%，RSD值分別為2.83%、1.39%、1.12%、2.17%、2.09%，表明本方法的加樣回收率符合規定。

2.5 L02肝細胞膜固相色譜對大黃活性成分吸附、解吸附

2.5.1 共孵育殘液的制備 L02肝脂肪變性細胞膜沉淀中加入1 mL大黃30%乙醇提取液，輕輕吹打，渦旋震蕩3 min，置于37 ℃恒溫水浴搖床孵育6 h。孵育結束后，孵育液于4 ℃、12 000×離心20 min，上清液過0.22 μm濾膜，即得共孵育殘液。

2.5.2 洗滌液的制備 L02肝脂肪變性細胞膜沉淀中加入1 mL蒸餾水，輕輕吹打混合均勻，4 ℃、12 000×離心20 min，重復洗滌3次，合并上清液，上清液過0.22 μm濾膜，即得洗滌液。

2.5.3 解離液的制備 L02肝脂肪變性細胞膜沉淀中加入1 mL 30%乙醇，輕輕吹打，渦旋震蕩3 min，置于37 ℃恒溫水浴搖床孵育4 h。孵育結束后，孵育液于4 ℃、12 000×離心20 min，上清液過0.22 μm濾膜，即得解離液。

按照相同條件重復上述操作，制得6份共孵育殘液、解離液。采用“2.4.1”項下色譜條件測定大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液、洗滌液及解離液。

2.6 大黃調血脂活性成分的體外驗證

2.6.1 細胞存活率的測定 將5、10、20 μmol/L的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及阿托伐他汀（0.125、0.250、0.500 μmol/L）分別作用于L02肝細胞脂肪變性模型，按“2.2.1”項下方法檢測細胞存活率。

2.6.2 細胞內TG、TC含量的測定 將10 μmol/L的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及阿托伐他汀（0.50 μmol/L）分別作用于L02肝細胞脂肪變性模型，按“2.2.2”項下方法測定細胞內TG、TC含量。

2.6.3 油紅O染色 取處于對數生長期的L02細胞，以2×105/cm2接種于6孔板（已鋪玻璃爬片），每孔1 mL，待貼壁后分為正常組、模型組和蘆薈大黃素組，正常組加入培養基，模型組和蘆薈大黃素組加入0.50 mmol/L油酸，蘆薈大黃素組再加入10 μmol/L蘆薈大黃素，培養24 h，吸去培養基，PBS洗滌2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定15 min，加入1 mL油紅O工作液，室溫避光、密封染色30 min，吸出染液，用10%異丙醇沖洗，每次3～5 s，吸出洗液，加蘇木素染液復染1 min（用于染細胞核），純水洗去藍色染液，甘油明膠封片。于光鏡下觀察細胞內橘紅色脂滴情況。

3 結果

3.1 L02肝脂肪變性細胞模型的建立

油酸刺激L02肝細胞建立脂肪變性模型，本方法較為簡便、快速，常用于脂代謝研究；其原理為饑餓狀態的肝細胞對油酸攝入增加，使細胞代謝發生障礙，肝細胞中的脂肪粒沉積加重及TG、TC含量增加。如圖1-A所示，與正常組相比，當油酸濃度由0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L逐漸增加，細胞存活率逐漸下降，表明高濃度油酸對細胞有一定毒性；當油酸濃度為0.25、0.50 mmol/L時，細胞存活率大于85%。如圖1-B所示，與正常組比較，模型組細胞內TG、TC含量上升，表明肝脂肪變性細胞模型造模成功；當油酸濃度由0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L逐漸增加，細胞中TG、TC含量先增加后減少；TG、TC含量減少原因在于：油酸濃度為1.00、1.50 mmol/L時，造成一定數量細胞死亡，所以其TG、TC含量下降。結合細胞存活率和TG、TC含量，選擇0.5 mmol/L油酸為最佳造模濃度。

圖1 細胞存活率(A) 及TG、TC含量(B)(, n = 6)

3.2 L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜評價

對L02肝脂肪變性細胞膜進行膜蛋白含量和Na＋, K＋-ATP酶活性測定，結果見表3。L02肝脂肪變性細胞膜蛋白質量濃度為0.602 2 mg/mL，Na＋, K＋- ATP酶活力為11.38 U/mg，表明L02肝脂肪變性細胞膜沉淀具有活力。

表3 細胞膜蛋白含量和Na＋, K＋-ATP酶活力

Table 3 Membrane protein content of cells and Na＋, K＋- ATPase activity

編號細胞膜蛋白/(mg·mL?1)Na＋, K＋-ATP酶/(U·mg?1) B10.598 811.76 B20.602 811.03 B30.607 511.35 平均值0.602 211.38

3.3 HPLC吸附分析

大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液、混合對照品溶液、洗滌液、解離液色譜圖見圖2。

由圖2-A可知，優化色譜條件下，多數成分色譜峰分離度良好，能夠較全面地反映相關化學成分信息；對比大黃30%乙醇提取液和共孵育殘液色譜峰的峰面積，部分共孵育殘液色譜峰峰面積顯著減小，表明部分化學成分被L02肝脂肪變性細胞膜吸附。由圖2-B可知，通過混合對照品溶液保留時間（R）及紫外光譜圖對比，初步確定7～11號色譜峰分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，1～6號色譜峰為未知成分。洗滌液中所含化學成分較少，表明活性成分與細胞膜結合牢固，不易洗滌下來。解離液中未檢測到色譜峰，推測活性成分通過特定的靶點進入細胞膜內部發揮調血脂作用。

將6份大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液進樣分析，對比其色譜峰峰面積變化，計算色譜峰峰面積RSD值，結果見表4、5。6份大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液色譜峰峰面積RSD均小于1%，表明在優化色譜條件下，該測定方法穩定可靠。

以大黃30%乙醇提取液和共孵育殘液色譜峰峰面積差值大于15%為依據，篩選L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜特異性吸附成分，結果見表6。大黃30%乙醇提取液中共有11種成分色譜峰峰面積的變化率大于15%；但由于對照品有限，僅初步確認7～11號色譜峰為蒽醌苷元；5種蒽醌苷元峰面積變化率大于32%，提示其與L02肝脂肪變性細胞膜上的靶點有較好的結合能力。

3.4 大黃調血脂活性體外驗證

5種大黃蒽醌苷元作用于L02肝脂肪變性細胞模型，其細胞存活率結果見表7。5種蒽醌苷元濃度大于10 μmol/L時，細胞存活率小于85%，提示蒽醌苷元（20 μmol/L）對細胞具有一定的毒性作用，故選擇10 μmol/L蒽醌苷元進行后續調血脂作用的驗證。

A-大黃30%乙醇提取液和共孵育殘液色譜圖 B-混合對照品溶液、洗滌液和解離液色譜圖 1～6-未知成分 7-蘆薈大黃素 8-大黃酸 9-大黃素 10-大黃酚 11-大黃素甲醚

表4 大黃30%乙醇提取液色譜峰峰面積變化(n = 6)

Table 4 Peak area change of 30% ethanol extract of Rhei Radix et Rhizoma(n = 6)

峰號tR/min峰面積 S1S2S3S4S5S6RSD/% 113.125 018 8445 067 7625 081 8235 089 8215 095 3905 054 8290.56 214.243 825 3553 864 7903 824 6733 833 5833 881 6163 840 6460.60 328.373 367 1053 393 1223 378 3893 392 5973 381 5763 337 6870.61 429.675 979 1256 031 8965 985 2896 017 7126 055 6886 080 5670.65 534.58765 629755 313767 195752 116754 214766 8990.93 637.631 673 7151 672 6811 695 7631 665 9971 662 2081 699 2160.93 741.611 216 3401 215 0021 215 9361 218 8441 203 9491 219 2260.46 846.091 210 1981 216 8731 227 3011 208 4881 220 3311 215 5720.57 953.79401 388407 512409 669405 375402 895405 2140.74 1058.55435 529441 594439 307446 090443 376440 8550.82 1160.4483 01082 30181 18482 36881 87681 3830.83

表5 共孵育殘液色譜峰峰面積變化(n = 6)

Table 5 Peak area change of co-incubation residual solution (n = 6)

峰號tR/min峰面積 S1S2S3S4S5S6RSD/% 113.124 061 5794 057 8754 046 6554 034 5594 030 3684 053 9830.31 214.243 073 8623 070 5703 062 3343 057 7763 049 2133 075 4000.33 328.372 506 7052 491 1932 492 2752 479 5342 471 9412 467 9560.58 429.674 219 6154 206 1134 202 2614 196 5194 180 7554 175 8490.39 534.58558 850557 234555 456552 487552 043550 5370.59 637.631 377 2571 373 9351 369 2211 363 6511 359 6571 356 7850.59 741.61548 516546 598544 134544 273540 734540 6560.57 846.09838 137833 508830 540829 140823 955825 3800.63 953.7978 01978 39477 93278 93578 30078 0410.47 1058.55114 621114 865114 499116 250115 118114 6800.56 1160.4410 71910 85610 83710 78410 79510 6000.87

表6 L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜吸附差異結果

Table 6 Results of adsorption difference of L02 hepatic steatosis membrane solid phase chromatography

峰號tR/min30%乙醇提取液色譜峰峰面積共孵育殘液色譜峰峰面積峰面積變化/%成分 113.125 081 8234 057 87520.15未知 214.243 824 6733 070 57019.72未知 328.373 378 3892 491 19326.26未知 429.675 985 2894 206 11329.73未知 534.58767 195557 23427.37未知 637.631 695 7631 373 93518.98未知 741.611 215 936546 59855.05蘆薈大黃素 846.091 227 301833 50832.09大黃酸 953.79409 66978 39480.86大黃素 1058.55439 307114 86573.85大黃酚 1160.4481 18410 85686.63大黃素甲醚

表7 大黃蒽醌苷元對L02肝脂肪變性細胞存活率的影響(n = 6)

Table 7 Effect of anthraquinone aglycone on survival rate of L02 hepatic steatosis cells (n = 6)

組別濃度/(μmol·L?1)細胞存活率/%組別濃度/(μmol·L?1)細胞存活率/% 蘆薈大黃素590.2大黃酚591.5 1088.7 1089.3 2081.5 2081.0 大黃酸593.1大黃素甲醚591.8 1088.6 1088.6 2079.3 2080.4 大黃素595.4阿托伐他汀0.12592.5 1087.8 0.25090.7 2075.6 0.50090.1

將5種蒽醌苷元（10 μmol/L）和阿托伐他汀（0.5 μmol/L）作用于L02肝脂肪變性細胞模型，TG、TC含量測定結果見圖3。與正常組比較，模型組細胞內TG、TC含量顯著升高（＜0.01），表明油酸誘導造模成功；與模型組比較，各給藥組細胞內TG、TC含量均顯著降低（＜0.01），表明5種蒽醌苷元可以通過降低TG、TC含量而達到調血脂作用，其中大黃素甲醚下調TG效果最強，而蘆薈大黃素下調TC效果最強。

油紅O/蘇木素染色L02肝脂肪變性細胞，細胞內脂肪滴情況見圖4。油紅O染色后，正常組細胞中藍色為細胞核，細胞核周圍無紅色脂肪粒。模型組細胞形態不規則，細胞出現腫脹變大，部分細胞膜不完整和破損；細胞核周圍有大量紅色脂肪粒。蘆薈大黃素作用于L02細胞肝脂肪變性模型，細胞核周圍的脂肪粒明顯減少，細胞形態有所改善，表明蒽醌苷元通過清除肝細胞脂質堆積，改善肝臟內脂質代謝，并保護肝細胞功能達到調血脂作用。

A-正常組 B-模型組 C-蘆薈大黃素組 D-大黃酸組 E-大黃素組 F-大黃酚組 G-大黃素甲醚組 H-阿托伐他汀組 與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

圖4 油紅O染色圖片 (×400)

4 討論

本研究構建L02肝脂肪變性細胞膜固相色譜耦合脂肪變性模型，利用L02肝脂肪變性細胞膜表面靶點選擇性吸附大黃調血脂活性成分，以吸附前后化學成分色譜峰峰面積變化率大于15%為依據，從大黃30%乙醇提取液中共篩選出11種活性成分；將5種大黃蒽醌苷元作用于L02肝脂肪變性細胞模型，發現蘆薈大黃素等蒽醌苷元能夠顯著降低L02肝脂肪變性細胞中TG、TC含量，并可顯著減少細胞核周圍的脂肪粒。本模型具有快速、方便的優勢，可用于大黃調血脂活性成分的快速篩選，也可適用于其他中藥調血脂活性成分的快速篩選及活性成分群關系的研究。

本方法將活性細胞膜作為固定相，具有細胞膜完整、膜受體立體結構、周圍環境和靶點得以保持的優勢，能夠排除大量非作用雜質成分的干擾，是中藥效應成分的有效篩選手段；但同時也存在細胞膜吸附1～2次后，細胞膜活性顯著降低，使用壽命短及吸附成分不一定是入血成分等缺陷。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Rapid screening of active components frometfor hypolipidemia by L02 hepatic steatosis cell membrane

WU Xiao-yu1, 2, 3,DUAN Wen-da1, XIA Peng-fei1, 2, 3, WANG Yu-xia1, BIAN Hui-qin1,ZHAO Lei1, 2, 3

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicine of Colleges of Gansu Province, Lanzhou 730000, China 3. Gansu Province Engineering Laboratory for Traditional Chinese Medicine Standardization Technology and Popularization, Lanzhou 730000, China

To rapid screening the active components from Dahuang (et) for hypolipidemia through L02 liver steatosis cell membrane solid phase chromatography coupled with steatosis model.The active compounds of 30% ethanol extracts frometwere combined with L02 cell membrane solid phase chromatography. The solution was detected before and after treating with L02 cell membrane by HPLC. The active compounds from 30% ethanol extracts ofetwere identified based on retention time and ultraviolet spectrum information of each chemical composition. The selected active ingredients were further applied to L02 hepatic steatosis cell model to verify the effect of hypolipidemia.A total of 11 compounds were detected from 30% ethanol extract ofet, and identified as aloe emodin, rhein, rheum emodin, chrysophanol, physcion and six unknown ingredients. Aloe emodin and other anthraquinone aglycones significantly reduced the contents of triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in L02 hepatic steatosis cell (< 0.01), and reduced the lipid granules in L02 hepatic steatosis cell.The established L02 liver steatosis cell membrane solid phase chromatography coupled with steatosis model can be used for rapid screening of active components in the complex system of traditional Chinese medicine, as well as to lay the foundation for further study of the active components in hypolipidemia ofet.

et; L02 hepatic steatosis cells; cell membrane solid phase chromatography; active components; aloe emodin; rhein; rheum emodin; chrysophanol; physcion

R285.5

A

0253 - 2670(2022)03 - 0735 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.012

2021-09-30

國家自然科學基金資助項目（82160457）；甘肅省教育廳：青年博士基金項目（2021QB-079）；甘肅中醫藥大學引進人才科研啟動基金（2018YJRC-02）；甘肅中醫藥大學科研發展基金項目（81660577）

武曉玉（1983—），女，副教授，從事中藥藥效物質基礎研究。E-mail: wxypzw@163.com

趙 磊，女，教授，博士生導師，從事中藥藥效物質基礎及質量控制研究。Tel: (0931)8762539 E-mail: zzyhx@gszy.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]