臺灣擬金發蘚二苯甲酮類化學成分及其細胞毒活性研究

劉麗娜，張學文，侯芳潔，段緒紅, ，趙建成，陳玉玲

臺灣擬金發蘚二苯甲酮類化學成分及其細胞毒活性研究

劉麗娜1，張學文3，侯芳潔2，段緒紅2, 3*，趙建成3*，陳玉玲3

1. 衡水市人民醫院 藥學部，河北 衡水 053000 2. 河北中醫學院藥學院，河北省中藥炮制技術創新中心，河北 石家莊 050200 3. 河北師范大學生命科學學院，河北 石家莊 050016

對臺灣擬金發蘚全草的化學成分及其細胞毒活性開展研究，為其進一步開發提供科學依據。采用硅膠、Sephadex LH-20凝膠、MCI-Gel樹脂柱色譜、半制備型RP-HPLC等多種色譜技術進行分離純化，運用波譜方法對所分離的化合物進行結構鑒定，采用MTT法測試化合物對人肝癌HepG2細胞和人胰腺癌PANC-1細胞的細胞毒活性。從臺灣擬金發蘚植物中分離得到4個化合物，分別鑒定為2′′-(1-苯甲酰基-2-羥基-4-苯氧基)--(2′′′-羥基-乙基)-乙酰胺（1）、(2-羥基-4-甲氧基-苯基)-苯基-甲酮（2）、(2,4-二甲氧基-苯基)-苯基-甲酮（3）、(2,4-二羥基-苯基)-苯基-甲酮（4）；部分化合物顯示出了一定的細胞毒活性。化合物1為新化合物，命名為金發蘚酮B；化合物2～4為新天然產物，首次從金發蘚科植物中分離得到；化合物1對人肝癌HepG2細胞具有較強的細胞毒活性，其半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為38.14 μmol/L。

金發蘚科；臺灣擬金發蘚；二苯甲酮；金發蘚酮B；細胞毒活性

臺灣擬金發蘚為金發蘚科擬金發蘚屬植物臺灣擬金發蘚(Hedw.) G. L. Sm. 的干燥全草。廣泛分布于我國四川、云南、貴州等西南省區。常生長于林下潮濕土壁，植株體相對較大。金發蘚科植物因植株較高大、容易被識別與采集、藥用歷史記載悠久而備受關注，近年來，陸續有學者對該科植物的化學成分及藥理活性開展了系列研究，從中得到了一系列結構新穎的活性化合物[1-5]。課題組前期也從該植物中分離得到了部分生物活性較好的化合物[6]，為了進一步開發利用該植物資源，本實驗繼續對臺灣擬金發蘚植物進行了化學成分研究，從中分離得到了4個二苯甲酮類化合物（圖1），分別鑒定為2′′-(1-苯甲酰基-2-羥基-4-苯氧基)--(2′′′-羥基-乙基)-乙酰胺[2′′-(1-benzoyl-2- hydroxy-4-phenoxy)--(2′′′-hydroxy-ethyl)-acetamide，1]、(2-羥基-4-甲氧基-苯基)-苯基-甲酮[(2-hydroxy- 4-methoxy-phenyl)-phenyl-methanone，2]、(2,4-二甲氧基-苯基)-苯基-甲酮[(2,4-dimethoxy-phenyl)- phenyl-methanone，3]和(2,4-二羥基-苯基)-苯基-甲酮[(2,4-dihydroxy-phenyl)-phenyl-methanone，4]。經Scifinder檢索，發現化合物1為新化合物，化合物2～4為新天然產物，首次從金發蘚科植物中分離得到。初步藥理結果顯示，化合物1對人肝癌HepG2細胞具有較強的細胞毒活性，其半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值為38.14 μmol/L。化合物2～4對HepG2細胞和人胰腺癌PANC-1細胞的增殖均無顯著影響。

圖1 化合物1～4的化學結構

1 儀器與材料

Agilent 6530B Q-TOF質譜儀（美國Agilent公司）；X-5A顯微熔點測定儀（鞏義市科瑞儀器有限公司）；Bruker AV-500核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；二氧化碳培養箱（上海BPN-240CRH公司）；SYNERGY多功能酶標儀（美國Bio Tek公司）；R-1020旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；柱色譜用硅膠（100～200、200～300目，青島海洋化工有限公司）；GF254預制硅膠板（青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH-20（Pharmacia公司）；ODS柱色譜材料（YMC公司）；MCI柱色譜材料（MCI-gel CHP-20P，日本三菱公司）；安捷倫1200型半制備HPLC分析儀器（高效液相色譜儀）；制備用色譜柱：Zorbax Prep HT GF（250 mm×21.2 mm，7 μm）；色譜乙腈和色譜甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；水（自制，Milli-Q型超純水機）；其他試劑為分析純（天津市科密歐化學試劑有限公司）；HepG2細胞、PANC-1細胞細胞株（美國ATCC）。

臺灣擬金發蘚樣品2019年10月采于貴州梵凈山國家級自然保護區，標本經河北師范大學生命科學學院趙建成教授鑒定為金發蘚科擬金發蘚屬植物臺灣擬金發蘚(Hedw.) G. L. Sm.的全草。憑證標本（HBSD2019110401）保存于河北師范大學生命科學學院系統與進化實驗室。

2 提取與分離

稱取臺灣擬金發蘚曬干植株1.3 kg，粉碎成粗粉后過30目篩，并用95%乙醇浸泡提取5次（每次溶劑用量5 L，提取時間3 d），過濾后合并提取液，減壓濃縮成稠浸膏（39.1 g）。將粗提物用熱水分散后，依次用石油醚（30～60 ℃）、二氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取。各極性部位萃取液再減壓濃縮，得萃取物。其中二氯甲烷萃取物（7.5 g），上MCI凝膠柱，用甲醇-水溶劑系統梯度洗脫，90%甲醇洗脫部分減壓濃縮得浸膏（3.1 g），該浸膏用5 g硅膠（100～200目）濕法拌樣，烘干，干法上樣，過150 g硅膠（200～300目）柱色譜，采用石油醚-丙酮（10∶1、5∶1、3∶1、3∶2、1∶1）梯度洗脫，分成5個餾份Fr. 1～5。Fr. 2（850 mg）通過ODS柱（依次用30%、60%、90%甲醇洗脫）得到7個亞組分Fr. 2.1～2.7。將Fr. 2.2用適量甲醇溶解，采用反相色譜柱法，以60%乙腈-水溶液為流動相，體積流量為15 mL/min進行制備液相分離，收集17.5 min色譜峰，得化合物粗品，粗品再經 Sephadex LH-20 柱純化后得化合物1（7.1 mg）；Fr. 2.3經制備柱色譜（甲醇-水53∶47，8 mL/min）得到Fr. 2.3.1～2.3.5，再將Fr. 2.3.3經半制備柱色譜得到化合物3（9.2 mg，R＝31.4 min，乙腈-水21∶79）。Fr. 2.5經制備柱色譜（甲醇-水40∶60，8 mL/min）得到Fr. 2.5.1～2.5.4，將Fr. 2.5.1經半制備柱色譜得到化合物2（8.8 mg，R＝17.3 min，乙腈-水32∶78）。將Fr. 2.5.3經半制備柱色譜得到化合物4（5.9 mg，R＝42.6 min，乙腈-水18∶82）。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末（氯仿）；HR-ESI-MS/: 316.118 2 [M＋H]+（計算值316.117 9），推測其分子式為C17H17O5N，不飽和度為10。紫外光譜在241（1.50）、284（2.35）、325（1.33）nm處顯示出了吸收峰。紅外光譜提示結構中含有羥基（3319 cm?1），羰基（1898 cm?1），苯環（3058、1640、1503 cm?1）等基團。1H-、13C-NMR（表1）顯示化合物中存在17個碳和17個氫原子。其中低場區顯示有8個芳香氫信號；H7.63 (1H, d,= 8.6 Hz, H-6), 6.47 (1H, dd,= 8.6 1.4 Hz, H-5), 6.60 (1H, d,= 1.4 Hz, H-3) 信號顯示存在1個1,2,4-三取代苯環偶合系統；同時還存在1個單取代苯環結構片段H7.70 (2H, d,= 7.4 Hz, H-2′, 6′), 7.56 (2H, d,= 7.4 Hz, H-3′, 5′), 7.62 (1H, dd,= 7.4, 1.2 Hz, H-4′)；高場區氫信號顯示存在1個連氧亞甲基信號H4.63 (2H, s, H-2′′)；1個連氧乙基信號H3.60 (2H, m, H-1′′′), 3.85 (2H, m, H-2′′′)。13C-NMR譜中給出了17個碳信號，結合DEPT和HSQC譜，可以推斷含有1個連氧亞甲基碳信號（C66.7）、1個連氧乙基碳信號（C61.6, 41.5）、8個次甲基碳信號（C102.3, 106.2, 128.4, 128.4, 127.9, 127.9, 131.3, 135.2）和6個季碳信號（C113.9, 137.6, 162.7, 165.6, 167.6, 199.7），并對直接相連的1H- 和13C-NMR信號進行了準確歸屬（表1）。通過文獻報道[6]比對，發現該化合物與2-(4-benzoyl-3- hydroxyphenoxy)--propylacetamide的NMR信號非常相似，主要不同之處在于少了1個甲基信號。同時在HMBC（圖2）中，H-2′、H-6′與C=O (C199.7) 的相關信號以及H-3′、H-5′與C-1′ (C137.6) 的相關信號證實了B環為單取代，且C-1′與羰基相連；H-6 (H7.63) 與C-1 (C113.9)、C-4 (C165.6) 和C-7 (C199.7) 存在相關信號，H-3 (H6.61) 與C-1 (C113.9)、C-5 (C106.2) 存在相關信號，同時H4.63與C165.6 (C-4) 的相關信號表明乙氧基側鏈與C-4相連，充分印證了A環為ABX偶合系統；也提示上述A、B環構成了1個二苯甲酮的結構片段；H4.63與C167.6 (C-1′′) 的相關信號表明連氧亞甲基與羰基直接相連；H-1′′′ (H3.60) 與C-2′′′ (C61.6)、H-2′′′ (H3.85) 與C-1′′′ (C41.5)的相關信號，H-1′′′與H-2′′′的COSY相關信號印證了乙基結構片段的存在；H3.61與C167.6 (C-1′′) 的遠程相關信號，-NH (H7.01) 與H-1′′′的COSY相關信號提示乙基連接在酰胺基團的N原子上。至此，化合物1的結構確定為2′′-(1-苯甲酰基-2-羥基-4-苯氧基)--(2′′′-羥基-乙基)-乙酰胺，經Scifinder檢索，化合物1為1個新化合物，命名為金發蘚酮B。

表1 化合物1的NMR數據(500/125 MHz, CDCl3)

Table 1 NMR data (500/125 MHz, CDCl3) for compound 1

碳位δcδH 1113.9 (s) 2162.7 (s) 3102.3 (d)6.60 (1H, d, J = 1.4 Hz) 4165.6 (s) 5106.2 (d)6.47 (1H, dd, J = 8.6, 1.4 Hz) 6135.2 (d)7.63 (1H, d, J = 8.6 Hz) 2-OH 12.63 (1H, s) NH 7.01 (1H, brs) 7199.7(s) 1′137.6 (s) 2′, 6′128.4 (d)7.70 (2H, d, J =7.4 Hz) 3′, 5′127.9 (d)7.56 (2H, d, J = 7.4 Hz) 4′131.3 (d)7.62 (1H, dd, J = 7.4, 1.2 Hz) 1′′167.6 (s) 2′′ 66.7 (t)4.63 (2H, s) 1′′′ 41.5 (t)3.60 (2H, m) 2′′′ 61.6 (t)3.85 (2H, m)

圖2 化合物1的主要COSY ()及HMBC () 相關

化合物2：淡黃色結晶（甲醇），mp 65～67 ℃；ESI-MS/: 229.2 [M＋H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 12.61 (1H, s, 2-OH), 7.56 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′, 6′), 7.50 (1H, dd,= 7.5, 1.5 Hz，H-4′), 7.47 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 7.41 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.45 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3), 6.33 (1H, dd,= 8.9, 2.0 Hz, H-5), 3.79 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 200.0 (C=O), 166.3 (C-2), 166.2 (C-4), 138.2 (C-1′), 135.2 (C-6), 131.4 (C-4′), 128.8 (C-2′, 6′), 128.2 (C-3′, 5′), 113.1 (C-1), 107.3 (C-5), 101.0 (C-3), 55.6 (-OCH3)。以上數據與文獻報道一致[7]，故鑒定化合物2為 (2-羥基-4-甲氧基-苯基)-苯基-甲酮，經Scifinder檢索，為首次從天然產物中分離得到。

化合物3：淡黃色結晶（甲醇），mp 86～88 ℃；ESI-MS/: 243.3 [M＋H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7.69 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′,6′), 7.45 (1H, dd,= 7.5, 1.5 Hz, H-4′), 7.35 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 7.33 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.48 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3), 6.43 (1H, dd,= 8.9, 2.0 Hz, H-5), 3.79 (3H, s, -OCH3), 3.62 (3H, s, -OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 195.5 (C=O), 163.3 (C-2), 159.6 (C-4), 138.8 (C-1′), 132.3 (C-6), 132.1 (C-4′), 129.6 (C-2′, 6′), 127.9 (C-3′, 5′), 121.5 (C-1), 104.5 (C-5), 98.8 (C-3), 55.6 (-OCH3), 55.5 (-OCH3)。以上數據與文獻報道一致[8]，故鑒定化合物3為 (2,4-二甲氧基-苯基)-苯基-甲酮，經Scifinder檢索，為首次從天然產物中分離得到。

化合物4：白色結晶（甲醇），mp 142～143 ℃；ESI-MS/: 215.2 [M＋H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7.64 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, dd,= 7.5, 1.5 Hz, H-4′), 7.53 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 7.51 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.49 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3), 6.37 (1H, dd,= 8.9, 2.0 Hz, H-5)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 200.3 (C=O), 166.1 (C-2), 162.9 (C-4), 138.2 (C-1′), 136.2 (C-6), 131.6 (C-4′), 128.9 (C-2′, 6′), 128.4 (C-3′, 5′), 113.6 (C-1), 107.7 (C-5), 103.7 (C-3)。以上數據與文獻報道一致[9]，故鑒定化合物4為 (2, 4-二羥基-苯基)-苯基-甲酮，經Scifinder檢索，為首次從天然產物中分離得到。

4 抗腫瘤活性測定

參考文獻方法[10]，采用MTT法檢測化合物1～4對HepG2細胞和PANC-1細胞的體外細胞毒活性。結果表明，化合物1可顯著抑制HepG2細胞的增殖，抑制作用表現出了劑量相關性，50 μmol/L的抑制率達到62%，IC50值為38.14 μmol/L，顯示出了較強的細胞毒活性。而化合物2～4對HepG2和PANC-1細胞增殖無顯著影響。

5 討論

本實驗對臺灣擬金發蘚95%乙醇水浸提物的二氯甲烷萃取部位進行分離純化，得到4個二苯甲酮類化合物，其中化合物1為新化合物，化合物2～4為新天然產物。體外細胞毒活性實驗表明，化合物1對HepG2細胞具有較好的細胞毒活性。

前期研究發現，金發蘚科金發蘚屬植物金發蘚[11]和小金發蘚屬植物東亞小金發蘚[12]均含有二苯甲酮類，與擬金發蘚屬臺灣擬金發蘚植物具有高度相似性，說明該科上述三個屬植物的親緣關系較近，這也與三者在植物形態上具有相似性相吻合，可以從化學分類學角度對金發蘚科植物分類提供一定的參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Benzophenones from endohydric mossand their cytotoxic activities

LIU Li-na1, ZHANG Xue-wen3, HOU Fang-jie2, DUAN Xu-hong2, 3, ZHAO Jian-cheng3, CHEN Yu-ling3

1. Department of Pharmacy, Hengshui People′s Hospital, Hengshui 053000, China 2. Traditional Chinese Medicine Processing Technology Innovation Center of Hebei Province, School of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China 3. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China

To investigate the chemical constituents and cytotoxic activity of the whole plant of, and provide scientific basis for its further development.Various chromatographic techniques such as silica gel, Sephadex LH-20 gel, MCI-Gel resin column chromatography and semi-preparative RP-HPLC were used for separation and purification. Their structures were elucidated by spectroscopic data analyses. The cytotoxicity of compounds for HepG2 and PANC-1 cells line was also evaluated by using the MTT method.Four compounds were isolated and identified as 2′′-(1-benzoyl-2-hydroxy-4-phenoxy)--(2′′′-hydroxy-ethyl)-acetamide (1), (2-hydroxy-4-methoxy-phenyl)-phenyl-methanone (2), (2,4-dimethoxy-phenyl)-phenyl-methanone (3), and (2,4-dihydroxy-phenyl)-phenyl-methanone (4). Some compounds showed certain cytotoxic activity.Compound 1 is a new compound named pogonatone B; Compounds 2—4 are new natural products, and isolated from Polytrichaceae species for the first time; Compound 1 also displays the high cytotoxicity on HepG2 cell with IC50values of 38.14 μmol/L.

Polytrichaceae;(Hedw.) G.L.Sm.; benzophenones; pogonatone B; cytotoxic activity

R284.1

A

0253 - 2670(2022)03 - 0667 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.003

2021-10-12

國家自然科學基金資助項目（31070184）；河北中醫學院博士科研基金資助項目（BSZ2021020）；全國中藥特色技術傳承人才培訓項目（T20194828003）

劉麗娜（1974—），副主任中藥師，研究方向為中藥鑒定及制劑開發。E-mail: 18631811807@163.com

段緒紅（1982—），博士，副主任中藥師，研究方向為中藥化學與炮制。E-mail: duanxuhong@126.com

趙建成（1956—），教授，博士生導師，研究方向為蘚類植物化學與分類。E-mail: zhaojiancheng@mail.hebtu.edu.cn

[責任編輯 王文倩]