花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的SSR標記技術鑒別

王海閣，許 文，張 勛，許少華，徐 偉，林 羽，陳抒云，黃澤豪

花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的SSR標記技術鑒別

王海閣，許 文，張 勛，許少華，徐 偉，林 羽，陳抒云，黃澤豪*

福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122

利用SSR分子標記技術建立金線蓮基原植物花葉開唇蘭及其常見混淆品臺灣銀線蘭的鑒別依據。根據花葉開唇蘭轉錄組數據進行分析篩選SSR引物，通過DNA提取、PCR擴增以及引物多態性篩選等方法鑒別花葉開唇蘭及臺灣銀線蘭，從而鑒定藥用金線蓮真偽?；诨ㄈ~開唇蘭轉錄組數據篩選出SSR多態性引物13對，UPGMA聚類法顯示兩者遺傳相似系數變幅為0.38～1.00，在遺傳相似系數0.38處，可將其完全分開。該研究構建了花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的分子標記鑒定體系和指紋圖譜，為金線蓮的商品鑒別及質量控制提供科學依據。

花葉開唇蘭；臺灣銀線蘭；SSR分子標記；真偽鑒別；指紋圖譜

金線蓮是來源于蘭科（Orchidaceae）金線蘭屬Blume多年生草本植物花葉開唇蘭(Wall.) Lindl.的新鮮或干燥藥材[1]，別名有金線蘭、金絲草、金絲線、虎頭蕉、金蠶等[2-3]。金線蓮性平、味甘，具有清熱涼血、解毒消腫、祛風利濕等多種功效，藥用歷史悠久，有“藥王”“金草”“藥虎”之稱[4]，在民間有很高的認知度，多用于治療腎炎、膀胱炎、肺炎、高血壓、小兒急驚風、風濕病、糖尿病、高脂血癥、乙型肝炎等疾病[5-7]。由于它自身繁殖能力很低，生長緩慢，且隨著部分地區生態環境的破壞以及過度采挖，導致金線蓮野生資源日漸枯竭，遠遠不能滿足市場需求，《國家重點保護野生植物名錄》第二批討論稿將其列入國家二級保護植物名列。根據本課題組前期考證結果，臺灣地區習以金線蘭屬植物臺灣銀線蘭Hayata作為金線蓮的原植物[8]，由于二近緣種外觀相似[9]，干品藥材顏色特征弱化，加之常有不法商販將其與花葉開唇蘭混用，導致人們往往難以區分兩者真偽。另外，目前關于花葉開唇蘭和臺灣銀線蘭的鑒別主要是性狀、顯微方面的鑒別[10-12]，隨著分子標記技術在植物鑒別方面的日益盛行以及簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）標記具有數量豐富、多態性高、遺傳上呈現共顯性、穩定性高等[13]的優點，該研究將首次應用SSR分子標記技術來研究該兩種植物基因水平的差異，以便為快速準確鑒別花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭提供鑒別依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

供試樣品為2019年5月29日從福建省永泰縣綠茵農業發展有限公司采集的林下栽培花葉開唇蘭和臺灣銀線蘭，并由福建中醫藥大學中藥鑒定教研室黃澤豪教授鑒定為花葉開唇蘭(Wall.) Lindl.和臺灣銀線蘭Hayata。選取種植至5月份的長勢良好、新鮮、無病蟲害的金線蓮，取3個不同種植間隔距離的藥材進行取樣，并及時選取新鮮幼嫩葉片分別進行相應平行3組的DNA提取，經PCR擴增及電泳檢測，平行3組實驗條帶一致，說明DNA提取的重復性良好，且由于不同生長期的植株其基因組成是不變的，因此2種藥材各自選取其中1份樣品進行后續的分子標記實驗研究。

1.2 儀器

DP22X奧林巴斯顯微鏡（上海富萊光學科技有限公司），佳能相機（佳能有限公司），FastPrep-24 5G型勻漿儀（上海博誼生物科技有限公司），自動高壓滅菌器（廣州市華粵行儀器有限公司），Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司），ABI Veriti梯度PCR儀（哈爾濱德遠科技開發有限公司），AR224CN型分析天平（奧豪斯儀器有限公司），PowerPac Basic伯樂電泳儀、垂直電泳槽、化學發光成像儀（美國Bio-Rad公司）等。

1.3 試劑

新型植物基因組DNA提取試劑盒、Gold View I型核酸染色劑（康為世紀生物科技），SSR引物（由上海生工生物工程股份有限公司合成），瓊脂糖（賽默飛世爾科技有限公司），6×Loading buffer、DNA marker（寶生物工程有限公司）等，試劑均為分析純。

2 方法

2.1 DNA提取

取花葉開唇蘭和臺灣銀線蘭完整植株的無病蟲害的完整葉片，按照DNA提取試劑盒法提取樣品DNA，用紫外檢測儀檢測DNA濃度，260/280應介于1.8～2.0，用2.0%濃度瓊脂糖檢測目的基因的純度，條帶應單一明亮說明產物較純。

2.2 PCR擴增

根據本課題組花葉開唇蘭轉錄組數據[14]，按照引物設計原則篩選SSR引物，即（1）引物序列的GC含量在40%～60%；（2）3’端無相似性較高的序列，且無連續3個GGG或CCC的出現，防止引起錯配；（3）引物長度一般為18～22 bp；（4）避免在3’端使用堿基A，防止形成二聚體或發卡結構；（5）引物本身的互補性不超過8，且引物3’端的互補性不宜超過6，防止在錯配位點形成雙鏈結構引發DNA聚合反應。SSR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應體系為25 μL，包括2.5 μL 10×Taq reaction buffer，2 μL dNTP Mixture，滅菌水16.3 μL，酶0.2 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板 2 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，各引物退火溫度退火45 s，72 ℃延伸90 s，4 ℃保存，用1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測是否擴增出目的基因以及目的基因的純度。

2.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測引物多態性

2.3.1 制膠 用75%乙醇清洗玻璃板，晾干或用醫用紗布塊擦干，將前后玻璃板對齊合板，置于裝有膠條的制膠架上，將滅菌水灌滿玻璃槽，檢漏20 min。然后按照灌膠配方制備配膠溶液，即依次加入超純滅菌水15 mL，30% Acr-Bis（29∶1）11.25 mL，5×TBE 7.5 mL，10% AP（催化劑）375 μL以及TEMED（加速劑）30 μL，用渦旋振蕩器迅速混勻，立即灌膠，及時插入梳子的平端，避免產生氣泡，室溫放置2 h使膠凝固。

2.3.2 電泳 將2板固定在垂直電泳槽中，短板朝內，預電泳30 min，緩慢拔出梳子，將25 μL PCR體系和4 μL 6×Loading buffer混合液加入凝膠的梳子孔中，上樣量4 μL，點樣結束后，以135 V、400 mA的程序電泳100 min。

2.3.3 銀染 將膠板從垂直電泳槽中取出，用起膠器將短玻璃板分離，膠留在長玻璃板上，用固定液沖洗凝膠使其與長玻璃板分離，置入固定液固定10 min，倒出固定液，用超純水快速漂洗1遍，加入染色液，振搖10 min，快速漂洗2遍，再加入顯色液，振搖至條帶凝膠上的條帶全部顯現出來，快速用超純水漂洗2遍，防止顯色過度，隨后對顯色后的凝膠掃描拍照，保存。

2.4 數據處理

對銀染后的凝膠圖進行條帶統計，同一位點清晰明亮的條帶記為“1”，無條帶的記為“0”，建立原始矩陣[15-16]，用NTsys 2.10軟件計算遺傳相似系數，以及非加權平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）生成品種間親緣關系的聚類圖，并結合Popgene 1.32軟件對引物的多態性以及個體間的遺傳分化進行分析。

3 結果與分析

3.1 SSR標記引物多態性

基于課題組前期花葉開唇蘭轉錄組測序的基礎上，設計30對SSR引物對樣品DNA進行PCR擴增，篩選多態性引物（圖1），其中條帶清晰、穩定性好的引物13對，占所用引物的43.3%。Popgene 1.32軟件分析表明（表1），平均觀察等位基因數為1.796 2，平均有效等位基因數為1.492 3，Shannon’s 多態性信息指數為0.442 6，表明花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭之間存在豐富的遺傳多樣性。引物信息如表2所示。

1～2-花葉開唇蘭 3～4-臺灣銀線蘭 kb-空白對照 M-Marker

1—2-3—4-kb-blank control M-Marker

圖1 引物RN42對花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的SSR-PCR凝膠電泳圖

Fig. 1 Results of SSR-PCR polyacrylamide gel electrophoresis by RN42 primers

表1 13對SSR引物的多態性

Table 1 Polymorphism of 13 pairs of SSR primers

編號等位基因有效等位基因Shannon信息指數基因流 RN322.000 01.600 00.562 30.500 0 RN332.000 01.600 00.562 30.500 0 RN352.000 01.600 00.562 30.500 0 RN362.000 01.600 00.562 30.500 0 RN372.000 01.600 00.562 30.500 0 RN382.000 01.600 00.562 30.500 0 RN411.000 01.000 00.000 0— RN422.000 01.600 00.562 30.500 0 RN431.000 01.000 00.000 00.000 0 RN442.000 02.000 00.693 10.100 0 RN462.000 01.600 00.562 30.500 0 RN502.000 01.600 00.562 30.500 0 AR79621.000 01.000 00.000 00.000 0 平均值1.769 21.492 30.442 60.403 6 標準方差0.438 50.301 30.254 9—

3.2 聚類分析

運用數據分析軟件NTsys軟件的UPGMA法對13對引物擴增出的多態性位點進行花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的聚類分析（圖2），由圖2可知遺傳相似系數變幅為0.38～1.00，在遺傳相似系數0.38處，可將花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭分開。Popgene 1.32軟件分析結果表明，花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭之間存在著一定的遺傳距離，距離值為0.450 2，且遺傳相似系數不高，為0.637 5，結合表1中的基因流＜1，可以看出表明兩者之間存在較高的遺傳分化。

3.3 SSR指紋圖譜構建

通過對13對SSR引物擴增結果進行分析，最終篩選出6對具有顯著多態性的SSR引物（RN33、RN35、RN37、RN42、RN44、RN46），在相同的遷移位置上，以“１/0”標記擴增條帶的有無，構建花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的DNA分子指紋圖譜（表3）。在實際應用進行區分時，可與構建的指紋編碼進行對比進行品種間的區分。

4 討論

本實驗篩選出13對SSR多態性引物可用于對花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的鑒別，NTsys軟件分析結果表明花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭之間存在一定的遺傳距離，且在遺傳相似系數0.38處可將兩者區分開；Popgene軟件分析結果表明所用SSR引物多態性高，花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭之間存在較高的遺傳分化，因此，根據SSR分子標記的結果建立花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的遺傳聚類圖譜和指紋圖譜，可為市場上藥用金線蓮商品的鑒別以及質量控制能起到有益的幫助。

表2 13對多態性SSR引物序列

Table 2 Thirteen pairs of SSR primer sequences

引物名稱正向序列（5’-3’）反向序列（5’-3’） RN32TGAACCCGATTTGCCTTTACTGTGACTATTGCGTTTTGTGC RN33CCGCTACGTCGGAACTTTACACCCAGCCATTGTCATCTTC RN35AGGAGGCCACACAATTCAACATTGGACCACCTGACACCAT RN36CCAAGAACTCCCTGTGCAATACGCCCTTCTTCTTCCTAGC RN37CCTCTGGCTCCATCTTCAACAGCTCATCCTTGTTCCCCTT RN38GGAGAGTCCAACACCGACATGCATGGAAAAGCTAGCACCT RN41GAGGTTCTGGAGCAGTGGAGTCGAGTGATTGGTGTGTGGT RN42ACAAGAAGGTGGAGGTGGTGCACCCTACTGCGTCCATTCT RN43CCCAACCTGTTTGACTCGTTGGGCAGGGATTTCTAGGTTC RN44GCTCACTGCGAAAAGGAACTGCGCCCCATCTCATAACTT RN46GCTTGAGGATGACGAAGAGGAGTCGGAGAAGGGGAGAGAG RN50GCTTTACCACCAGCTCAAGGTCGCCATGAATTCCTAGTCC AR7962TGGGCCGGTTAAGTTGTTAGGACCTGTGGTTCATGGGACT

圖2 花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭的UPGMA聚類圖

SSR是基于生物基因組普遍存在且隨機分布的一種特殊序列，由于具有重復性及可靠性高等優勢[17]，已被廣泛應用于遺傳多樣性分析[18]、指紋圖譜的構建[19]、群體遺傳結構分析[20]、分子標記輔助育種[21]等。近年來，DNA分子標記也開始在金線蓮的鑒別中得到應用，如Cheng等[22]首次用RAPD標記對臺灣金線蓮和恒春銀線蘭進行鑒別，黃穎楨等[23]首次應用ISSR標記對金線蓮的遺傳多樣性進行研究。本實驗基于花葉開唇蘭轉錄組測序的基礎上，選用合適的引物，首次應用SSR技術對花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭進行生藥鑒別研究，分子生藥學鑒定研究表明，花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭存在一定的遺傳分化。因此，該研究建立的分子標記技術鑒定金線蓮真偽的方法可以較好地區分市售花葉開唇蘭與臺灣銀線蘭，此方法的應用也可以為藥用金線蓮真偽的鑒別提供一個便捷的實驗途徑。

表3 6對特異性SSR引物多態性情況及構建的指紋圖譜

Table 3 Fringerprints constructed by six pairs of polymorphic SSR primers

樣本引物指紋編碼 RN33RN35RN37RN42RN44RN46 花葉開唇蘭10111111111111011011111111111101 臺灣銀線蘭11011010010001111101101001000111

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 福建省中藥材標準[S]. 2006: 155.

[2] 鐘岑生. 金線蓮的藥用價值與開發 [J]. 廣西農業科學, 1997, 28(2): 102-104.

[3] 魏文文, 江新曉, 林秀蓮. 金線蓮研究現狀 [J]. 園藝與種苗, 2016, 36(7): 6-8.

[4] 屈信成, 嚴克儉, 羅小珍, 等. 金線蓮與灰巖金線蓮的性狀與顯微鑒別研究 [J]. 中國藥業, 2016, 25(22): 35-37.

[5] 曾健, 林競成, 黃堅航. 金線蓮的應用與開發 [J]. 海峽藥學, 1996, 8(4): 82-83.

[6] 陳卓, 黃自強. 金線蓮降血糖作用的初步研究 [J]. 福建醫藥雜志, 2000, 22(S1): 207-208.

[7] 許文江, 陳裕, 林坤瑞. 藥用野生金線蓮植物資源的研究 [J]. 福建熱作科技, 2000, 25(4): 9-10.

[8] 鄭麗香. 金線蓮的資源調查及生藥學研究 [D]. 福州: 福建中醫藥大學, 2018.

[9] 王海閣, 許文, 張勛, 等. 林下栽培金線蓮的生藥鑒別 [J]. 中藥材, 2020, 43(2): 303-308.

[10] 黃哲, 黨友超, 王世清. 黔產金線蓮與其易混品斑葉蘭的葉表皮顯微特征研究 [J]. 貴陽中醫學院學報, 2019, 41(2): 34-37.

[11] 黨友超, 黃哲, 李蒙禹, 等. 黔產金線蓮及其易混品(斑葉蘭)的顯微鑒定研究 [J]. 貴陽中醫學院學報, 2018, 40(4): 30-34.

[12] 易駿, 吳建國, 張秀才, 等. 不同植物基原金線蓮生藥鑒別 [J]. 中草藥, 2015, 46(23): 3570-3576.

[13] 李群, 張文蘭, 田茜, 等. 利用SSR標記技術鑒別玉米品種先玉696和先玉335的研究 [J]. 種子, 2017, 36(9): 121-123.

[14] 鄒福賢, 許文, 黃澤豪, 等. 金線蓮轉錄組測序及其黃酮類合成相關基因分析 [J]. 中國藥科大學學報, 2019, 50(1): 66-74.

[15] 陸敏佳, 蔣玉蓉, 陸國權, 等. 利用SSR標記分析藜麥品種的遺傳多樣性 [J]. 核農學報, 2015, 29(2): 260-269.

[16] 黃婷, 馬嘯, 張新全, 等. 多花黑麥草DUS測定中SSR標記品種鑒定比較分析 [J]. 中國農業科學, 2015, 48(2): 381-389.

[17] 尹躍, 安巍, 趙建華, 等. 黑果枸杞轉錄組SSR信息分析及分子標記開發 [J]. 浙江農林大學學報, 2019, 36(2): 422-428.

[18] 劉碩, 劉寧, 章秋平, 等. 中國華北和東北地區杏種質資源遺傳多樣性分析 [J]. 園藝學報, 2019, 46(6): 1045-1056.

[19] 倪維晨, 李瑞霞, 陶啟威, 等. 基于SSR標記的地方品種糯性小玉米自交系指紋圖譜構建 [J]. 浙江農業科學, 2019, 60(6): 911-914.

[20] Gu X Z, Cao Y C, Zhang Z H,. Genetic diversity and population structure analysis ofgermplasm accessions [J]., 2019, 18(6): 1312-1320.

[21] 楊娟, 王雯, 沈火林. 辣椒恢復基因SSR標記定位及分子標記輔助選擇育種 [J]. 中國瓜菜, 2010, 23(5): 1-5.

[22] Cheng K T, Fu L C, Wang C S,. Identification ofandspecies with RAPD markers [J]., 1998, 64(1): 46-49.

[23] 黃穎楨, 陳菁瑛, 趙云青, 等. 金線蓮遺傳多樣性的ISSR分析 [J]. 中草藥, 2014, 45(15): 2230-2234.

Identification ofandby SSR molecular markers

WANG Hai-ge, XU Wen, ZHANG Xun, XU Shao-hua, XU Wei, LIN Yu, CHEN Shu-yun, HUANG Ze-hao

College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China

The purpose of this paper was to research the identification characteristics ofand its adulterants ofbased on SSR molecular markers.Firstly, SSR primers were selected according to the transcriptome data of, and then the original plant ofand its adulterants ofwas identified by DNA extraction, PCR amplification and primer polymorphism screening, so as to identify the authenticity ofherba.By SSR molecular markers, 13 pairs of SSR primers clustering analysis showed that the genetic similarity coefficient ranged from 0.38 to 1.00 so thatandcould be separated at 0.38.In this study, the molecular marker identification system and fingerprints ofandare established, which could provide scientific basis for commodity identification and quality control ofherba.

(Wall.) Lindl.;Hayata; SSR molecular markers; identification; fingerprints

R286.12

A

0253 - 2670(2022)03 - 0848 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.025

2021-09-06

福建省自然科學基金資助項目（2017J01538）；福建省科技廳高校產學合作項目（2019Y41010064）；福建省科技廳引導性項目（2017Y0049，2018Y0052）

王海閣（1994—），女，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向為中藥資源及品質評價。Tel: 18750718127 E-mail: 2672831172@qq.com

黃澤豪，教授，研究方向為中藥資源及品質評價。Tel: 18046043849 E-mail: huangzehao@fudan.edu.cn

[責任編輯 時圣明]