基于Box-Behnken 響應面法優化清香木葉的揮發油提取工藝優化

李文莉，馬家寶，梁曉蓮，趙鳳仙，楊正騰

（1.廣西中醫藥科學實驗中心，南寧 530200；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530023；3.廣西壯瑤藥技術研究中心，南寧 530200）

清香木（Pistacia weinmannifolia）為漆樹科黃連木屬植物，別名紫油木、香葉樹，細葉楷木等，喜光、耐干旱，分布于廣西、四川、云南、貴州等地，生長于山坡、河谷地帶［1］。清香木樹根系發達、萌發力強、生命力旺盛，常用于石漠化治理及綠化改造［2，3］。在藥用方面，該樹具有芳香味，可驅逐蒼蠅、蚊子等害蟲，樹葉具有消炎、解毒、收斂、止血的功效，常用于痢疾、腸道炎的治療［4］。清香木葉揮發油中主要含有萜烯類、酮、酯、烷烴和醛類化合物，其中萜烯類化合物占絕大部分，使得其揮發油芳香氣味濃郁，并具有消毒殺菌、抗腫瘤、抗氧化的作用［5-9］。目前，關于清香木葉的揮發油提取工藝方面鮮見報道，本研究利用水蒸氣蒸餾法結合響應面分析法對清香木葉的揮發油提取工藝進行優化研究，為清香木的研究開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

清香木陰干葉子（廣西萬寶堂藥業有限公司提供）；揮發油提取器（天津市德固特科技有限發展公司）；SXKW 型數顯控溫電熱套（山海科恒實業發展有限公司）；PL203 型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；無水硫酸鈉（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 試驗方法

參照2020 版《中國藥典》一部的附錄XD，采用水蒸氣蒸餾法進行清香木葉揮發油的提取，然后用無水硫酸鈉進行脫水干燥，保存［10］。最終揮發油提取得率按得到的揮發油重量與清香木葉原料重量的比值進行計算。

1.2.1 單因素試驗

1）浸泡時間。分別準確稱取5 份150 g 清香木葉于3 000 mL 圓底燒瓶中，加入2 000 mL 去離子水，按不同浸泡時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）浸泡清香木葉，提取5 h，比較不同浸泡時間對清香木葉揮發油提取得率的影響。

2）加水量。分別準確稱取5 份150 g 清香木葉于3 000 mL 圓底燒瓶中，按不同加水量（6、8、10、12、14 倍）加入去離子水，浸泡2 h，提取5 h，比較不同倍數加水量對清香木葉揮發油提取得率的影響。

3）提取時間。分別稱取5 份150 g 清香木葉于3 000 mL 圓底燒瓶中，加入2 000 mL 去離子水，浸泡2 h，按不同提取時間（3、4、5、6、7 h）進行提取，比較不同提取時間對揮發油提取得率的影響。

1.2.2 響應面試驗設計 采用Box-Behnken 設計因素和水平，根據單因素試驗結果，確定浸泡時間（A）、加水量（B）、提取時間（C）影響因素的水平，以清香木葉揮發油提取得率作為響應值，得出三因素三水平響應面試驗設計，試驗因素和水平見表1。

表1 清香木葉揮發油提取正交試驗因素與水平

1.3 數據分析

根 據Design-Expert 8.0.6.1 軟 件Box-Behnken 中心組合設計原理采用三因素三水平響應面法對清香木葉的揮發油提取工藝進行優化，以揮發油得率為響應值，對試驗結果進行線性回歸分析，以確定清香木葉揮發油的最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 浸泡時間對清香木葉揮發油提取得率的影響 由圖1 可知，隨著浸泡時間的升高，清香木葉的揮發油提取得率在一定范圍內逐漸升高，這可能是因為藥材與水充分接觸需要足夠的時間，浸泡時間足夠，組織間隙就會增大，從而加快細胞內外液體的流動，最終使揮發油容易揮出，但當浸泡時間超過2.0 h 后，清香木葉與水分已充分接觸，再增加浸泡時間提取得率變化也不明顯。由此選擇1.5、2.0、2.5 h 作為響應面浸泡時間設計的3 個水平。

圖1 浸泡時間對清香木葉揮發油提取得率的影響

2.1.2 加水量對清香木葉揮發油提取得率的影響由圖2 可知，隨著加水量的增大，清香木葉揮發油提取得率也增大，當加水量增大到10 倍時，提取得率最高，因為揮發油是隨著水蒸氣而揮發的，當加水量很少時，水蒸氣少，揮發油不能完全提取出來，另外加水量少也不能使藥材完全浸透，容易發生糊化，提取得率降低，但加水量超過10 倍后，提取得率變化趨勢不明顯，可能是因為加水量太大，藥液濃度過低，提取出來的揮發油濃度也相對較低，并且還有部分揮發油溶于水，不利于分離。因此，選擇8、10、12倍加水量作為響應面設計的3 個水平。

圖2 加水量對清香木葉揮發油提取得率的影響

2.1.3 提取時間對清香木葉揮發油提取得率的影響 由圖3 可知，隨著提取時間的增加，清香木葉揮發油提取率也增加，當提取時間增加到5 h 后，再增加提取時間提取率變化較小，說明當提取時間很少時，揮發油還不能完全從清香木葉中蒸出，當提取時間增大到一定程度后，揮發油基本可以從藥材中蒸出，再增加提取時間提取得率幾乎不變，而且還增加了成本。因此，選擇4、5、6 h 作為響應面設計的3 個水平進行試驗。

圖3 提取時間對清香木葉揮發油提取得率的影響

2.2 響應面法優化清香木葉的揮發油試驗設計與結果

采用響應面法，運用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對清香木葉揮發油三因素三水平的提取條件進行優化，響應值為揮發油提取得率（Y）。將試驗結果進行線性回歸分析，所得試驗設計與結果見表2。

表2 清香木葉中揮發油Box-Benhken 試驗設計與結果

2.3 響應面方差結果分析

由表3 可知，該回歸模型P為0.002 1，小于0.01，失擬項P為0.179 9，大于0.05。表明該回歸模型具有顯著性，且該方程的擬合度相對較好，也具有相對較小的試驗誤差。在單因素中，A、B、C因素為極顯著因素（P＜0.01）；在二次項中C2為極顯著項，A2為顯著項，B2項不顯著；一次項交互作用只有AB為顯著項，其他各項皆不顯著。表明所選3 個因素浸泡時間、加水量及提取時間對清香木葉揮發油的提取得率具有顯著影響。在3 個因素兩兩組合中，浸泡時間與加水量的組合對提取得率的影響顯著，其余2 個組合影響不顯著。擬合所得到的二次方程為

表3 清香木葉的揮發油提取試驗響應面方差分析

Y=0.45+0.059A+0.051B+0.043C-0.038AB-0.015AC-0.020BC-0.042A2-0.032B2-0.060C2，相 關 系 數R2=0.935 6，說明該試驗設計較顯著、可靠。

2.4 因素間的交互作用

由響應曲面的彎曲程度和等高線的密集程度可以較好地分析各影響因素及因素之間的交互作用。由圖4、圖5、圖6 可較直觀地看出，清香木葉揮發油提取得率曲線最陡峭的為浸泡時間，表明其影響作用最顯著，提取時間影響最不顯著，表現為曲面平緩。通過對等高線進行分析，顯示浸泡時間和加水量的交互作用等高線最密集，表明其對清香木葉揮發油提取得率影響最顯著；而浸泡時間和提取時間的交互作用等高線最不密集，表明其對提取得率的影響最小。

圖4 浸泡時間和加水量對清香木葉揮發油提取得率的影響

圖5 浸泡時間和提取時間對清香木葉揮發油提取得率的影響

圖6 加水量和提取時間對清香木葉的揮發油提取得率的影響

2.5 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件得到清香木葉的揮發油最優提取條件為浸泡時間2.23 h，加水量為10.93 倍，提取時間為5.22 h，提取率為0.481 2%。取3 份清香木葉按照上述最優提取工藝提取揮發油，得到清香木葉的揮發油平均提取得率為0.460 8%，與理論值相比降低了0.020 4 百分點，由此可以判斷，該模型可較好地預測試驗結果，具有較好的實際應用價值。

3 小結

常用的揮發油提取方法包括水蒸氣蒸餾法、壓榨法、溶劑法、微波萃取法、吸收法、二氧化碳超臨界萃取法等［11］。其中，水蒸氣蒸餾法因具有設備簡單、操作安全、成本低等優點而成為植物揮發油提取最常用的方法。本研究以水蒸氣蒸餾法對清香木葉揮發油的最佳提取工藝進行考察，選取浸泡時間、加水量、提取時間3 個工藝因素作為響應面參數水平，再利用Box-Behnken 響應面法進行試驗設計與分析，該法與傳統的正交設計相比較，模型預測性較好，分析方法更全面，更加接近實際情況。

清香木數量多、分布廣泛，目前對其研究較多的是用于石漠化治理和園林綠化方面，但研究表明，清香木具有驅邪除惡、安神、定心、順氣止痛、溫中利隔、固齒祛口臭、生津解渴的功效［1］，而清香木葉揮發油則具有抗菌抗腫瘤活性，對金黃色葡萄糖球菌、大腸桿菌、紅酵母均具有較強的抑制活性［5，6，12］，并且在體外對肺部炎癥也具有較顯著的抑制作用［13］。本研究得出的清香木葉揮發油提取工藝為清香木的開發利用提供了參考依據。本研究運用響應面進行設計優化試驗，建立回歸方程，預測出水蒸氣蒸餾法提取清香木葉的揮發油，提取工藝為浸泡時間2.23 h，加水量10.93 倍，提取時間5.22 h，提取得率為0.481 2%。在該條件下進行3 組平行試驗，揮發油平均提取得率為0.460 8%，與預測值結果相差不大，說明優化的揮發油提取工藝可以較準確地篩選出清香木葉揮發油的提取工藝參數。