異甘草素對體外肺纖維化模型的作用及其機制*

蔡風林，王梅芳，程雪琴，袁樂永，何金娟，胡雯雯，3，唐以軍

(1.湖北醫藥學院附屬太和醫院呼吸與危重癥醫學科，十堰 442000；2.湖北醫藥學院基礎醫學院免疫教研室，十堰 442000；3.錦州醫科大學十堰市太和醫院研究生培養基地，十堰 442000)

肺纖維化是一種由多種病因引起的以肺泡上皮細胞持續性損傷，成纖維及肌成纖維細胞過度增殖，細胞外基質異常沉積和肺組織結構病理性重構為特征的慢性進行性間質性肺部疾病[1-4]，其發病機制十分復雜，至今尚未完全闡明。大量研究表明肺泡上皮細胞發生的上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肺纖維的重要發病機制之一[1-2，4]。轉化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)是重要的促纖維化因子[1-3]，能夠誘導肺泡上皮細胞、腎小管以及肝細胞等多種上皮細胞發生EMT[5]。由TGF-β1介導肺泡上皮細胞發生的EMT是肺纖維化時肺內成纖維或肌成纖維細胞的重要來源，在此過程中TGF-β1促使肺泡上皮細胞向間質細胞轉化，導致成纖維或肌成纖維細胞增多，細胞外基質過度生成，從而促進肺纖維化的發生發展[1-5]。異甘草素(isoliquiritigenin，ISL)是從中草藥甘草和青蔥的根中提取的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、免疫調節及抗腫瘤等多方面的作用[3，6-10]，對多種疾病具有潛在的治療價值。此外，研究表明ISL可通過調控炎癥[6-9]、氧化應激[8]、免疫反應[10]、自噬[3]及成纖維細胞活化[3，6]等多種途徑抑制眼結膜、胰腺、心肌、腎、脂肪和肺等多臟器纖維化。但ISL能否通過調控肺泡上皮細胞EMT發揮抗肺纖維化作用的研究，筆者未見相關報道。因此，筆者在本研究以A549細胞作為研究對象，通過TGF-β1誘導其發生EMT構建體外肺纖維化模型[2]，探討ISL對肺纖維化的作用及可能機制，以期為肺纖維化的臨床防治提供理論依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1主要藥物與試劑 ISL(Solarbio公司，批號：SI8220)；TGF-β1(Novoprotein公司，批號：CA59)；達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)高糖培養基(Gibco公司，批號：8120324)；胎牛血清(FBS，Gibco公司，批號：2045521CP)；100X青霉素-鏈霉素溶液(Gibco公司，批號：2240831)；噻唑藍(MTT)粉末(Beyotime，批號：ST316)；Trizol(TaKaRa公司，批號：9109)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR036A)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR820A)；全蛋白提取試劑盒(Solarbio公司，批號：BC3710)；BCA蛋白質濃度測定試劑盒(Solarbio公司，批號：PC0020)；兔GAPDH單克隆抗體(CST，批號：5174)；兔Erk1/2單克隆抗體(CST，批號：4695)；兔p-Erk1/2單克隆抗體(CST，批號：9101)；兔上皮型鈣粘蛋白(E-cadherin)單克隆抗體(Abcam，批號：ab40772)；兔神經型鈣粘蛋白(N-cadherin)單克隆抗體(Abcam，批號：ab76011)；兔波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(Abcam，批號：ab92547)；兔α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)單克隆抗體(Abcam，批號：ab5694)；鼠纖維連接蛋白(FN)單克隆抗體(Santa Cruz，批號：SC-8422)；山羊抗兔IgG/辣根酶標記二抗(華安生物，批號：HA1001)；山羊抗小鼠IgG/辣根酶標記二抗(華安生物，批號：HA1006)。

1.2A549細胞培養 人肺泡Ⅱ型上皮A549細胞購于中國科學院上海細胞庫。將A549細胞置于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)的恒溫細胞培養箱中，用含100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素及10%FBS的DMEM高糖培養基進行培養，每2～3 d更換DMEM完全培養基1次，待細胞生長至90%～100%基本匯合狀態時按1：2或1：3進行消化傳代。

1.3體外肺纖維化模型的構建 根據文獻[11-14]，選取10 ng·mL-1TGF-β1誘導A549細胞發生EMT，構建體外肺纖維化模型。將培養至對數期的A549細胞接種于6孔板中，待其生長至約50%，用無血清DMEM基礎培養基處理24 h后，分為對照組(含DMEM完全培養液)及TGF-β1組(含10 ng·mL-1TGF-β1的DMEM完全培養液)，繼續培養24，48，72 h，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和Western blotting實驗檢測EMT相關蛋白表達情況，確定體外肺纖維化細胞模型是否構建成功。

1.4MTT實驗檢測細胞增殖情況 將A549細胞制成單細胞懸液，按每孔100 μL(含細胞5×103個)接種于96孔板中，四周邊緣孔用磷酸鹽緩沖溶液填充。培養24 h待細胞完全貼壁，用無血清DMEM基礎培養基饑餓處理24 h后，將A549細胞分為空白對照組 (無細胞及藥液 )、陰性對照組(含細胞，但無藥液 )、實驗組 (含10，20，40，60，80，100，200 μmol·L-1的ISL)。將含或不含10 ng·mL-1TGF-β1的各濃度ISL與A549細胞分別孵育24，48，72 h后，棄去培養液，向每孔中加入含有10%MTT(5 mg·mL-1)的無血清DMEM基礎培養液100 μL，繼續培養4 h，棄去培養液，向每孔中加入二甲亞砜100 μL，置搖床上低速晃動10 min后，使用酶標儀測量各孔在492 nm波長處吸光度(A值)。細胞抑制率(%)=(陰性對照組A值-實驗組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。根據計算得出的抑制率，選取作用于A549細胞的適宜ISL濃度。

1.5細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將A549細胞按每孔3.5×105種植于6孔板中，培養24 h，待細胞生長至100%基本融合時，用200 μL槍頭在6孔板細胞表面做“十”字垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次后，將其分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+ISL組及ISL組。對照組加入含1%FBS的DMEM培養基，其余組按分組要求加入用該培養基稀釋的藥物，0，24，48 h時采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞遷移情況，并在倒置相差顯微鏡40倍條件下對其進行攝像，使用ImageJ軟件對所獲取的圖像進行分析。

1.6倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態 將A549細胞以每孔1.5×105接種在6孔板中，培養24 h，待A549細胞生長至約50%，用無血清DMEM基礎培養基饑餓處理24 h后，分為對照組(含DMEM完全培養基) 、TGF-β1組(含10 ng·mL-1TGF-β1的DMEM完全培養基)、TGF-β1+ISL組(含10 ng·mL-1TGF-β1及60 μmol·L-1ISL的DMEM完全培養基)、ISL組(含60 μmol·L-1ISL的DMEM完全培養基)。在ISL及TGF-β1作用0，24，48，72 h時于倒置相差顯微鏡100倍條件下觀察各組細胞形態變化并拍照記錄。

1.7RT-PCR檢測EMT及EMT相關轉錄因子mRNA的表達 將A549細胞接種于6孔板中，按上述實驗分組干預48 h。根據Trizol說明書上步驟，提取各組細胞的RNA，收集于1.5 mL EP管中，在DNA/RNA濃度測定儀上測定RNA純度及濃度，再按照反轉錄試劑盒說明書上的步驟將RNA反轉錄成CDNA，最后按照熒光定量檢測試劑盒說明書操作步驟用RT-PCR法檢測EMT及EMT相關轉錄因子mRNA的表達情況，GAPDH作為內參。RT-PCR反應條件：95 ℃ 30 s 1個循環；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個循環；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s 1個循環。各個基因的相對表達水平以 2( Ct內參基因-Ct目的基因 )進行統計分析。RT-PCR檢測所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

1.8Western blotting檢測EMT相關蛋白及通路相關蛋白的表達 在ISL及TGF-β1干預A549細胞48 h后，提取細胞總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度后，取制備好蛋白樣品，按30 μg等量上樣，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳(80 V，40 min后轉為120 V，70 min)、半干轉膜法轉膜(恒壓20 V，40～60 min)、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h、一抗4 ℃孵育過夜、 TBST洗膜(5次，每次5 min)、二抗室溫孵育2 h、TBST洗膜(5次，每次5 min)，最后在蛋白印記檢測系統進行電致化學發光(electrochemilumin-escence，ECL)顯影。使用Image J軟件計算目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值，得到目的蛋白的相對灰度值進行分析。

2 結果

2.1TGF-β1誘導A549細胞構建體外肺纖維化模型 結果見圖1。與對照組比較，10 ng·mL-1TGF-β1刺激24，48，72 h后，A549細胞形態由鵝卵石樣多邊形上皮細胞向紡錘體樣長梭形間質細胞轉變，細胞間隙變大，細胞與細胞間連接變得松散，呈現出成纖維細胞表型樣改變，在24，48 h時該現象較明顯。與對照組比較，A549細胞在10 ng·mL-1TGF-β1作用24，48，72 h后，上皮細胞標志物E-cadherin表達下調；間質細胞標志物N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA表達上調，并且在TGF-β1刺激A549細胞48，72 h時該趨勢較明顯。

①與對照組比較，t=6.20～31.76，P<0.01；②與對照組比較，t=4.45，P<0.05。圖1 TGF-β1誘導A549細胞構建體外肺纖維化細胞模型①compared with control group，t=6.20-31.76，P<0.01；②compared with control group，t=4.45，P<0.05.Fig.1 TGF-β1 induces A549 cells to construct a lung fibrotic cell model in

2.2ISL抑制A549細胞增殖 結果見圖2。不同濃度ISL對A549細胞增殖活性產生明顯影響，隨著ISL給藥劑量的增加和作用時間的延長，ISL對A549細胞的增殖抑制率呈顯著上升趨勢。

圖2 ISL對A549細胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of ISL on A549 cell proliferation

2.3ISL抑制TGF-β1誘導的A549細胞增殖和遷移 與對照組比較，隨著作用時間的延長，TGF-β1組細胞存活率逐漸升高；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ISL (0～200 μmol·L-1)組細胞隨ISL濃度增加及給藥時間的延長細胞活性逐漸降低，結果見圖3A。在10 ng·mL-1TGF-β1及60 μmol·L-1ISL作用A549細胞24，48 h后，與對照組比較，TGF-β1組細胞劃痕距離隨著作用時間的延長逐漸縮窄，ISL組細胞劃痕距離增寬；并且TGF-β1+ISL組與TGF-β1組比較，細胞劃痕距離也明顯增寬，見圖3B及3C。

①與對照組比較，t=5.59～26.19，P<0.01；②與對照組比較，t=3.85，P<0.05；③與TGF-β1組比較，t=13.6，17.7，P<0.01。圖3 ISL對TGF-β1誘導的A549細胞增殖及遷移的影響①compared with control group，t=5.59-26.19，P<0.01；②compared with control group，t=3.85，P<0.05；③compared with TGF-β1 group，t=13.6，17.7，P<0.01.Fig.3 Effect of ISL on the proliferation and migration of A549 cells induced by

2.4ISL抑制TGF-β1誘導的A549細胞形態變化 與對照組比較，經TGF-β1刺激的A549細胞形態變得細長，由原來緊密相連的鵝卵石狀上皮細胞逐漸轉變成連接松散的紡錘體樣長梭形細胞，細胞間隙變大且細胞間連接變得松散，呈現出間質細胞樣表型特征，而ISL組細胞形態未見明顯改變；與TGF-β1組比較，TGF-β+ISL組細胞形態變得稍飽滿，更傾向于對照組鵝卵石狀上皮細胞形態，見圖4。

圖4 ISL對TGF-β1誘導A549細胞形態的影響Fig.4 Effect of ISL on the morphology of A549 cells induced by TGF-β1

2.5ISL抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT及EMT相關轉錄因mRNA的表達 與對照組比較，TGF-β1組上皮細胞標志物E-cadherin表達下調，間質細胞標志物Vimentin、α-SMA、FN及EMT相關轉錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2表達上調，而ISL組E-cadherin表達上調，Vimentin、α-SMA、FN及EMT相關轉錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2表達下調；與TGF-β1組相比，TGF-β1+ISL組也是E-cadherin表達上調，Vimentin、α-SMA、FN及EMT相關轉錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1、ZEB2表達下調，見圖5。

A.對照組；B.TGF-β1組；C.TGF-β1+ISL組；D.ISL組；①與對照組比較，t=4.89～24.70，P<0.01；②與TGF-β1組比較，t=4.13～5.93，P<0.01；③與TGF-β1組比較，t=2.81～3.54，P<0.05。圖5 ISL對TGF-β1誘導的A549細胞中EMT及EMT相關轉錄因子表達的影響A.control group；B.TGF-β1 group；C.TGF-β1+ISL group；D.ISL group；①compared with control group，t=4.89-24.70，P<0.01；②compared with TGF-β1 group，t=4.13-5.93，P<0.01；③compared with TGF-β1 group，t=2.81-3.54，P<0.05.Fig.5 Effect of ISL on the expression of EMT and EMT-related transcription factors in A549 cells induced by TGF-β1

2.6ISL抑制TGF-β1誘導的A549細胞EMT相關蛋白及MAPK/Erk信號通路相關蛋白的表達 與對照組比較，TGF-β1組上皮細胞標志物E-cadherin表達下調，間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin、α-SMA、FN表達上調，而ISL組E-cadherin表達上調，N-cadherin、Vimentin、α-SMA、FN表達下調；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ISL組也是E-cadherin表達上調，N-cadherin、Vimentin、α-SMA、FN表達下調。與對照組比較，TGF-β1組p-Erk/ErK水平顯著增加，ISL組P-Erk/Erk水平顯著下降；與TGF-β1組比較，TGF-β1+ISL組p-Erk/Erk水平也明顯減少，見圖6。

3 討論

研究表明，血小板衍生生長因子、TGF-β1、結締組織生長因子和腫瘤壞死因子等眾多細胞因子參與EMT過程，其中TGF-β1被認為是最重要的促纖維化細胞因子[15-16]。本研究結果發現TGF-β1能夠誘導A549細胞從緊密連接的鵝卵石樣上皮細胞逐漸轉變為連接疏松的紡錘體樣成纖維細胞，但TGF-β1作用A549細胞72 h細胞形態變化不如TGF-β1作用A549細胞24及48 h明顯，這可能是由于細胞培養較長時間后數量增多，但細胞生長空間有限，彼此間相互擠壓導致；經Western blotting檢測，發現TGF-β1能減少上皮細胞標志物E-cadherin的表達，增加間質細胞標志物FN、N-cadherin、Vimentin、a-SMA的表達，且48，72 h時該趨勢更明顯，表明TGF-β1能誘導A549細胞發生EMT，成功構建體外肺纖維化細胞模型。

TGF-β1誘導肺泡上皮細胞發生的EMT是肺纖維化重要的發病機制[17-18]。在該過程中具有極性和細胞間連接結構的上皮樣表型細胞進行細胞骨架重組，細胞極性、細胞間緊密連接及黏附連接逐漸喪失，細胞遷移及侵襲能力增強，E-cadherin、細胞角蛋白19(CK-19)、胞質緊密黏連蛋白-1(ZO-1)和α-連環蛋白 (α-Catenin)等上皮細胞標志物表達降低，N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA等間質細胞標志物表達升高[18-21]，上皮細胞轉化為間質細胞，致使成纖維細胞增多，細胞外基質過度生成，從而促進肺纖維化疾病的發生發展。本研究結果顯示，ISL能阻止TGF-β1誘導的A549細胞形態由上皮細胞向成纖維細胞轉變，維護A549細胞上皮樣表型；ISL能提高TGF-β1誘導的A549細胞上皮標志物E-cadherin，降低間質細胞標志物N-cadherin、Vi-mentin、α-SMA、FN的表達水平。這些結果表明ISL能抑制TGF-β1誘導的A549細胞的增殖、遷移及EMT進程，阻止A549細胞發生形態學變化，減少肺成纖維細胞的生成，可能具有一定的抗肺纖維作用。

E-cadherin是分布于上皮細胞膜表面的典型上皮細胞標記物，它的表達隨著EMT的發展逐漸減少，是EMT過程中的關鍵事件[22]。據報道Snail、Slug、Twist、ZEB1和ZEB2是調控EMT過程的重要轉錄因子，它們不僅能與E-cadherin基因啟動子近端的E-box序列相互結合，直接或間接抑制E-cadherin的表達，而且還能通過其他途徑提高N-cadherin、Vimentin、FN等間質細胞標志物的表達，促進EMT的發生[16，18，20，22-23]。研究證實抑制ZEB1的表達可干預TGF-β1誘導A549細胞的EMT進程[18]，從而減輕肺纖維化。本研究結果顯示，ISL顯著抑制TGF-β1誘導的EMT相關轉錄因子Snail、Slug、Twist、ZEB1及ZEB2 mRNA的表達，因此推測ISL可能通過下調TGF-β1誘導的A549細胞中EMT相關轉錄因子的表達來抑制EMT進程，從而緩解肺纖維化。

細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，Erk)屬于MAPK家族重要一員，可參與調節細胞增殖、分化、凋亡等多種重要的細胞生理病理過程。MAPK/Erk信號通路在肺纖維化疾病中發揮著重要的作用，阻斷MAPK/Erk信號通路可抑制肺纖維化疾病的發生發展[23-26]。有研究表明阻斷MAPK/Erk信號通路可抑制TGF-β1誘導的EMT及肺成纖維細胞的增殖、分化及ECM沉積[1，23]，從而緩解肺纖維化。本研究結果顯示TGF-β1促進p-Erk1/2的表達，而ISL抑制p-Erk1/2的表達，這表明TGF-β1激活了MAPK/Erk信號通路，ISL抑制了MAPK/Erk信號通路。ISL有可能通過抑制TGF-β1激活的MAPK/Erk信號通路抑制EMT，從而具有抗肺纖維化的潛在作用。

綜上所述， ISL能夠抑制TGF-β1誘導的A549細胞的EMT進程，維護A549細胞上皮樣形態，減少肺成纖維細胞的產生。由于本研究未進一步使用抑制劑阻斷MAPK/ErK信號通路，因此只能推測ISL可能通過調節MAPK/Erk信號通路抑制TGF-β1誘導的A549細胞的EMT，進而緩解肺纖維化的發生發展，其具體的作用機制還有待進一步研究。