壯腎固精方治療IgA腎病的網絡藥理學機制

王艾琳， 劉立昌， 劉旭生， 劉新

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510006；2.廣東省中醫院珠海醫院，廣東珠海 519015）

IgA腎病（IgA nephropathy）是以血尿、蛋白尿、水腫、高血壓為主要臨床表現的原發性腎小球疾病，在我國的發病率較高，占原發性腎小球疾病的45%～50%。本病并非良性病變，超過1/3的IgA腎病患者發病20年后發展至終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD），是引起我國青年患者腎衰竭的常見病因[1]。目前，西醫臨床主要是應用血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（ARB）類藥物控制血壓，減少尿蛋白，穩定腎功能進展，對療效欠佳者可應用糖皮質激素或聯合免疫抑制劑治療，但激素及免疫抑制劑治療IgA腎病的同時往往帶來一些副作用。而中醫藥在IgA腎病的防治中發揮了重要作用，具有增強療效、改善腎功能、緩解癥狀、降低激素毒副作用等優勢。中醫學根據不同癥狀將IgA腎病歸為“尿血”“尿濁”“水腫”等范疇。本病為本虛標實、虛實夾雜之證，本虛主要指脾腎氣虛、肝腎陰虛、氣陰兩虛等，標實主要指熱毒、濕熱、瘀血。廣州中醫藥大學第二臨床醫學院劉新主任醫師在多年的臨床實踐中，對各家研究成果及個人經驗進行總結和歸納，創制以補腎健脾、活血固精、清熱利濕為組方原則的壯腎固精方，該方由黃芪、黃精、金櫻子、菟絲子、覆盆子、水蛭、野蕎麥根等中藥組成。本課題組前期臨床觀察初步證實壯腎固精方可有效降低蛋白尿和血尿水平[2-4]。為進一步明確壯腎固精方治療IgA腎病的作用機制以推廣臨床應用，故借助網絡藥理學方法進行分析預測。網絡藥理學結合了網絡生物學和多項藥理學，依托組學和大數據高速發展，能高效準確地預測中藥復方中的活性成分、作用靶標并發現其作用機制，從分子水平上闡述“病證”與“方藥”的關系[5]，為臨床使用中醫藥治療疾病奠定理論基礎。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 搜集壯腎固精方活性成分與作用靶點首先在TCMSP數據庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）中分別檢索壯腎固精方中的“黃芪”“黃精”“金櫻子”“菟絲子”“覆盆子”“野蕎麥根”，獲取這些藥物的活性成分。應用TCMID數據庫（http://www.megabionet.org/tcmid/）和SwissTargetPrediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預 測 出“水蛭”的相應指標。按照口服生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18的標準對所獲取的藥物活性成分進行篩選，得到這些藥物的有效化學成分以及有效成分相對應的作用靶點。然后應用Uniprot數據庫（https://www.uniprot.org/）對上述方法得到的藥物作用靶點名稱進行轉換，得到相對應的基因名。最后，通過Cytoscape 3.8.0生物信息分析軟件構建成分-靶點網絡圖，并進行拓撲分析。

1.2 搜集壯腎固精方治療IgA腎病的相關靶點在OMIM數據庫（https://www.omim.org/）、GeneCards數據庫（https://www.genecards.org/）及PharmGkb數據庫（https://www.pharmgkb.org/）中搜索關鍵詞“IgA nephropathy”（IgA腎病），獲得與IgA腎病相關的靶點。以上3個數據庫為使用率較高的人類疾病基因綜合檢索數據庫。然后使用半編程性質的腳本性軟件Rproject對3個數據庫搜集到的本疾病相關靶點進行剔重和匯總，并對壯腎固精方藥物靶點與IgA腎病相關靶點進行映射，構建Venn圖。

1.3 構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡與分析

將上述方法得到的相關基因導入STRING數據庫（http://stringdb.org），設定物種（Organism）為人類（Homosapiens），獲得PPI網絡，設置最高置信程度（highest confidence：0.9）作為篩選條件，導出.tsv格式文件，然后將其導入Cytoscape 3.8.0軟件，根據度（degree）值的排序得到排名前5位的基因，用CytoNCA組件篩選出PPI網絡中10個核心基因。

1.4 分析重要靶點的基因功能和信號通路使用R project軟件中的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot和ggplot2包對壯腎固精方治療IgA腎病的重要靶點進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，將富集分析得到的結果以條形圖和氣泡圖形式予可視化展示。

2 結果

2.1 壯腎固精方活性成分的篩選在TCMSP、TCMID數據庫及SwissTargetPrediction數據庫中，根據OB＞30%、DL＞0.18的標準共篩選出57個活性成分，其詳細信息見表1所示。

表1 壯腎固精方活性成分的篩選結果Table 1 Screening results of active ingredients in Zhuangshen Gujing Prescription

2.2 壯腎固精方活性成分-靶點網絡使用Cytoscape 3.8.0軟件構建成分-靶點網絡圖（見圖1），并進行網絡拓撲分析。結果顯示：成分-靶點網絡圖共包含138個節點，335條邊；度值前5位的活性成分為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、黃芩素（baicalein）、刺芒柄花素（formononetin）；度值前5位的靶點為PTGS2、PTGS1、PRSS1、DPP4、ESR1。

圖1 壯腎固精方活性成分-靶點網絡Figure 1 Ingredient-target network of Zhuangshen Gujing Prescription

2.3 壯腎固精方治療IgA腎病相關靶點的篩選在OMIM數據庫、GeneCards數據庫及PharmGkb數據庫中檢索得到與IgA腎病相關的靶點1 213個。使用R project軟件對壯腎固精方藥物靶點與IgA腎病相關靶點進行映射，取交集后構建韋恩（Venn）圖（見圖2），共 獲 得CDK2、ESR1、RELA、VEGFA、CDKN1A、MMP2、MMP9、NFKBIA、CXCL8、GSTP1、GSTM1、PTGS2、DPP4、PTGS1、ADRB2、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、NOS2、PPARG、PRSS1、IKBKB、AKT1、MAPK8、MMP1、STAT1、CDK1、HMOX1、CYP3A4、CYP1A1、ICAM1、SELE、VCAM1、ALOX5、SLPI、AKR1B1、MMP3、EGFR、CCND1、BCL2L1、FOS、PLAU、MAPK1、IL10RA、EGF、RB1、TP53、SOD1、HIF1A、HSPA5、ERBB2、CAV1、MYC、F3、IL1B、CCL2、NOS3、HSPB1、IL2RB、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、IFNG、IL1A、MPO、NQO1、PARP1、PPARA、CXCL10、CHUK、SPP1、RUNX2、E2F1、CD40LG、DPEP1、CYCS、G6PD、MAPK14、ADH1B、HPSE、CD44等87個交集基因。

圖2 壯腎固精方治療IgA腎病靶點的韋恩（Venn）圖Figure 2 The Venn graph of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

2.4 壯腎固精方治療IgA腎病的PPI網絡為了更全面地認識壯腎固精方治療IgA腎病的作用機制，將“2.3”項所得的疾病與藥物的交集靶點輸入STRING數據庫，構建靶標PPI網絡（見圖3）。網絡中共包含79個節點，301條邊。導出.tsv格式文件，然后將其導入Cytoscape 3.8.0軟件，根據度值的排序得到排名前5位的基因為PTGS2、PTGS1、PRSS1、DPP4、ESR1。利用CytoNCA組件篩選出PPI網絡中的核心基因，分別為TP53、AKT1、JUN、MAPK1、RELA、MAPK14、ESR1、MYC、MAPK8、FOS。見圖4。

圖3 壯腎固精方治療IgA腎病的PPI網絡Figure 3 The PPInetwork of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

圖4 PPI網絡中的核心基因Figure 4 Core genes of PPInetwork

2.5GO功能富集分析與KEGG通路富集分析GO富集分析的結果顯示：生物學過程（biological process，BP）主要與細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress）、對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）有關；細胞組件（cellular component，CC）主 要 與 薄 膜 筏 子（membrane raft）、微域膜（membrane microdomain）有關；分子功能（molecular function，MF）主要與DNA結合的轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、磷酸酶結合（phosphatase binding）有關。KEGG富集分析結果顯示壯腎固精方治療IgA腎病可能與絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、核因子kappa B信號通路（NF-kappa B signaling pathway）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號通路（PI3KAkt signaling pathway）、Janus激酶-信號轉導子和轉錄激活子信號通路（JAK-STAT signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、白細胞介素17信號通路（IL-17 signaling pathway）等有關。具體結果見圖5～圖6。

圖5 壯腎固精方治療IgA腎病靶點的GO功能富集分析Figure 5 GO enrichment analysis of targets of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

圖6 壯腎固精方治療IgA腎病靶點的KEGG富集分析Figure 6 KEGG enrichment analysis of targets of Zhuangshen Gujing Prescription in the treatment of IgA nephropathy

3 討論

IgA腎病屬于自身免疫性疾病，主要表現為IgA亞型的異常表達。缺乏半乳糖型IgA（Gd-IgA1）是一種可以與IgG或IgA1形成免疫復合物的抗聚糖自體抗體。形成的復合物沉積在腎小球系膜上，刺激系膜細胞增殖并促進細胞因子的聚集，繼而導致足突細胞基因表達和腎小球滲透性阻力指標的變化，逐漸發展為腎小球硬化和間質纖維化，并伴有腎功能受損，最終出現終末期腎臟病[6]。根據全球腎臟病預后組織（KDIGO）指南，目前IgA腎病的治療方案主要為抗蛋白尿和抗高血壓治療及應用糖皮質激素、免疫抑制劑和魚油[7]。對于高風險的患者，通常需要聯合使用糖皮質激素和免疫抑制劑。然而，這種治療方案會對患者機體造成較大損傷[8]。經過前期的臨床觀察，我們發現壯腎固精方可以有效減輕IgA腎病患者的蛋白尿和血尿水平，壯腎固精方聯合常規治療可以有效降低患者的毒副作用，但其治療機制尚不明確。

本研究通過步驟“2.2”項得到了有效成分-靶基因網絡，并進行拓撲分析，得到度值前5位的有效成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、刺芒柄花素。其中，槲皮素是菟絲子、金櫻子、金蕎麥、覆盆子、黃芪的共同有效成分，木犀草素是金蕎麥的有效成分，山柰酚是菟絲子、金櫻子、覆盆子、黃芪的共同有效成分，黃芩素是黃精的有效成分，刺芒柄花素是黃芪的有效成分。研究發現，槲皮素具有很好的抗炎作用，可以調節巨噬細胞極化，保護腎小球足細胞，從而改善腎臟損傷，還可以抑制NF-κBp65和Toll樣受體2（TLR2）蛋白的表達，以減輕腎臟氧化應激，延緩腎功能衰竭[9-11]。木犀草素能通過降低細胞內鈣離子濃度抑制腎動脈收縮，擴張已收縮的腎動脈，降低血壓，可聯合其他藥物治療IgA腎病進展過程中發生的高血壓，還可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，具有抗炎、抗氧化的作用[12-13]。方中多種藥物共有的有效成分山柰酚可通過抑制NF-κB介導的炎癥反應，對腎臟損害起到保護作用，還可以緩解腎組織病理損傷，抑制腎組織細胞凋亡，改善腎功能[14-15]。杜忠祥等[16]研究發現，黃芩素可以降低血清尿素氮（BUN）水平、提高腎臟組織超氧化物歧化酶（SOD）活性并降低丙二醛（MDA）含量，減輕腎臟組織細胞凋亡，對腎損傷有修復作用。

根據PPI網絡的分析，本研究結果顯示，雌激素受體1（ESR1）、蛋白激酶B1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等基因的度值較高，且屬于核心基因，因此，推測這些基因可能在壯腎固精方的起效過程中發揮明顯的靶向作用。有研究表明，ESR1可抑制TGF-β1/Smad信號通路，從而改善腎小管間質纖維化，保護腎功能[17]。Gong等[18]研究發現，過表達ESR1編碼的雌激素相關受體α（ERRα）可以促進大鼠腎小球系膜細胞的凋亡和炎癥反應。有研究證明，Akt的活化可使多聚體IgA（pIgA）與單核細胞上的FcαRI受體結合，形成循環pIgA-FcαRI復合物[19-20]，并沉積在腎小球系膜區，引發系膜細胞的炎癥反應，這一過程在IgA腎病發展中可能起關鍵作用[21]。MAPK參與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應等多個環節，起重要的調節、控制作用，已有研究證實其與IgA患者腎小管間質纖維化有關[22]，可以影響IgA患者的預后。

最后，本研究對壯腎固精方治療IgA腎病的重要靶點進行GO和KEGG富集分析。根據GO、KEGG分析結果，發現壯腎固精方起效的生物學過程主要與炎癥反應和氧化應激的反應有關：核因子E2相關因子2（Nrf2）是一種可以保護機體免受氧化應激和調節炎癥反應的關鍵轉錄因子，與機體炎癥反應和氧化應激反應有重要關系，而越來越多證據顯示，其在各類慢性腎臟病中發揮主要作用[23-25]。這表明氧化應激在IgA腎病的發展過程中具有重要作用。本研究所篩選出的有效成分及重要靶點的主要作用也顯示，壯腎固精方治療IgA腎病的作用機制主要與炎癥反應和氧化應激反應有關，這與GO、KEGG分析結果相符。可據此推測，壯腎固精方主要通過調控細胞炎癥反應和氧化應激過程發揮治療IgA腎病的作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學分析壯腎固精方治療IgA腎病的有效成分、作用靶點和起效機制，進一步闡釋了壯腎固精方的治療作用機制，為臨床選擇治療方案和后續基礎研究指明了方向和奠定了理論基礎。但由于壯腎固精方組成藥物較多，并且受限于當前數據庫，其發揮治療作用的具體機制尚需要更進一步的研究。