甘草素對非小細胞肺癌細胞放療敏感性的影響

代軍強， 劉鑫， 李甸源

（1.鄭州人民醫院放療科，河南鄭州 450000；2.許昌市中心醫院呼吸內科，河南許昌 461000；3.鄭州大學第一附屬醫院放療科，河南鄭州 450052）

肺癌是臨床常見的呼吸系統惡性腫瘤，發病率、死亡率居全球所有癌癥首位，且呈逐年上升的趨勢。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是除小細胞肺癌之外的所有肺上皮癌，主要包括腺癌、鱗狀細胞及大細胞癌，占肺癌總數的75%～80%[1-2]。目前，NSCLC的臨床治療以手術為主，并聯合術前后的輔助治療，包括放療、化療、免疫治療、靶向治療，控制腫瘤進展或復發[3]。其中，放療作為重要的輔助治療手段對提高治療效果、改善患者預后具有重要的意義，但腫瘤細胞對放療的耐受性降低了其療效[4]。因此，探討NSCLC放療耐受性機制以及尋找提高腫瘤細胞放療敏感性的藥物成為研究熱點。甘草素是從中藥甘草中提取的二氫黃酮化合物，具有抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等多種生物學效應[5-6]。體外細胞實驗表明，甘草素可增加三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231和BT549對多柔比星的敏感性，提高治療效果[7]。另外，有研究[8]證實，甘草素可增加肺癌細胞株H1299放療敏感性，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。基于甘草素具有增加化療及放療敏感性的作用，本研究以非小細胞肺癌A549細胞為研究對象，探討甘草素對NSCLC細胞放療敏感性的影響及其可能的作用機制，為甘草素相關藥物的研發及NSCLC的臨床治療提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養人NSCLC細胞株A549購自中國科學院上海細胞庫。復蘇人NSCLC細胞A549，加至體積分數10%優質胎牛血清的RPMI 1640培養基（NaHCO32.5 g/L、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素），置于體積分數為5%CO2、37℃恒溫恒濕密閉培養箱中，于鄭州大學醫學科學院培養。

1.2 藥品、試劑與儀器甘草素（純度≥98%，分子式：C15H12O4，分子量：256.25，批號：JOT-10442，成都普菲德生物技術有限公司生產）；miR-21擬似物（miR-21 mimics）和miR-21擬似物陰性對照（miR-21 mimics-NC）（廣州市銳博生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000（美國invitrogen公司）；細胞計數試劑盒8（CCK-8）（美國Sigma Aldrich公司）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin VFITC）凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；雙熒光素酶報告基因試劑盒（美國Promaga公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；兔抗人蛋白絡氨酸磷酸酶MEG2、β-actin等抗體和羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的免疫球蛋白（IgG）抗體（英國Abcam公司）。直線加速器（美國瓦里安醫療系統公司）；多功能酶標儀、蛋白凝膠電泳儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 CCK-8細胞毒性檢測實驗觀察不同濃度甘草素對A549細胞增殖的影響 取對數期A549細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，調整細胞密度為1×105個/mL，接種至96孔板，貼壁培養12 h后，加入不同濃度甘草素（0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L），另設空白組，設置5個復孔。24 h后，加入10μL的CCK-8試劑于培養箱中孵育4 h，應用多功能酶標儀于波長450 nm處檢測光密度（OD）值。計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率=（1-不同濃度藥物OD值/空白組OD值）×100%。后續實驗需聯合射線共同作用，因此選取接近于20%抑制濃度（IC20）的甘草素濃度進行后續實驗。

1.3.2 克隆形成實驗觀察細胞放療敏感性 取對數生長期A549細胞，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于6孔板，培養基中加入0.2 mmol/L甘草素作用48 h。另設空白組，采用不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）6 MV-X射線室溫照射，每組設5個復孔。照射野：10 cm×10 cm；源皮距：100 cm；劑量率：1 Gy/min。照射完畢，PBS清洗，甲醇固定30 min，Giemsa染色20 min，流水沖洗，室溫干燥，倒置顯微鏡下觀察。計算：克隆形成率=克隆細胞數/接種細胞數；細胞存活分數（survival fraction，SF）=照射后細胞克隆形成率/照射細胞克隆形成率。根據單擊多靶模型方程[9]：合細胞存活曲線，計算平均致死劑量（mean lethal dose，D0）和N，準閾劑量（quasi-threshold，Dq）=D0lnN，其中D為放射劑量，N為外推數或靶數。放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）定義：達到相同生物學效應時，單純照射的劑量/藥物干預照射的劑量，SERD0=空白組D0/干預組D0，SERDq=空白組Dq/干預組Dq。

1.3.3 細胞轉染與分組 將A549細胞按1×105個/mL接種于6孔板，隨機分為5組：對照組、甘草素組、miR-21 mimics-NC組、miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組。待細胞密度為70%時，對照組、甘草素組加入等體積分數Lipofectamine 2000的完全培養液，miR-21 mimics-NC組轉染miR-21 mimics-NC，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組轉染miR-21 mimics。按照Lipofectamine 2000說明書進行轉染：分別使用250μL Opti-MEM稀釋5μL Lipofectamine 2000和5μL miR-21 mimics-NC或miR-21 mimics，孵育5 min后，將2種稀釋物混合，形成復合物，將復合物加入6孔板進行轉染。轉染24 h后，熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效果，確定轉染效果良好后，甘草素組、甘草素+miR-21 mimics組加入0.2 mmol/L甘草素，其余各組加入等量細胞培養液作用24 h，采用4 Gy 6 MV-X射線照射后進行后續實驗。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞活力 收集各組細胞，PBS重懸，用細胞計數板對細胞懸液進行計數。調整細胞密度為1×105個/mL，接種至96孔板，每組設置5個復孔。貼壁培養12 h后，加入10μL CCK-8試劑。培養箱中孵育4 h后，應用多功能酶標儀于波長450 nm處檢測OD值。計算細胞相對活力：細胞相對活力（%）＝（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 收集各組細胞，4℃預冷的PBS清洗2次，以1 200 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min，加入500μL結合緩沖液重懸細胞。先后加入5μL Annexin V-FITC和PI室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測各組A549細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.3.6 定量聚合酶鏈反應（qPCR）法檢測細胞miR-21、MEG2 mRNA相對表達量 收集各組細胞，用TRIzol試劑提取組織中總RNA，應用紫外分光光度計檢測RNA濃度[OD（260 nm）/OD（280 nm）]，反轉錄為cDNA。反應條件：30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，4℃5 min。產物cDNA按照定量PCR試劑盒說明書進行Realtime PCR反應。反應條件：95℃5 min，94℃20 s，60℃20 s，40個循環。分別以U6和GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算miR-21和MEG2 mRNA的相對表達量。實驗重復3次。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequences

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-21與MEG2的靶向關系 通過Starbase V2.0、PicTar、TargetScan等數據庫預測分析miR-21與MEG2之間的結合位點，將MEG2的3’UTR區域，插入雙熒光素酶報告基因pmirGLO中，構建野生型pmirGLO-MEG2-3’-UTR wild type和 突 變 型pmirGLO-MEG2-3’-UTR mutant重組質粒。將A549細胞按1×105個/mL接種至24孔板，使用Lipofectamine 2000將報告質粒與miR-21 mimics或miR-21 mimics-NC共轉染。24 h后，每孔加入100μL Passive Lysis Buffer置于搖床上裂解15 min，于4℃、12 000 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min。轉移上清至24孔板，每孔加入100μL Luciferase Assay ReagentⅡ、20μL細胞裂解液，應用熒光測定儀檢測內參發光值。再加入100μL stop&GLO Reagent，熒光測定儀檢測報告基因發光值。實驗重復3次。

1.3.8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測細胞MEG2蛋白表達水平 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。95℃金屬浴使蛋白變性，進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜儀將蛋白轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入MEG2（1∶1 000稀釋）、β-actin（1∶1 000稀釋）一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10 min/次。再加入HRP標記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。最后，將PVDF膜浸入電化學發光液（ECL），于暗室中曝光顯影，應用ImageJ軟件對膠片蛋白條帶進行灰度分析，以目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值，作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.4 統計方法采用SPSS24.0統計軟件對實驗數據進行分析，所有實驗數據以均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度甘草素對A549細胞增殖的影響隨著甘草素濃度增加，細胞增殖抑制率升高（P＜0.05），表明不同濃度甘草素均可抑制A549細胞增殖，其中0.2 mmol/L濃度的甘草素對A549細胞增殖的抑制率為（20.43±1.86）%，接近于IC20。為確保后續實驗有效性，故選取甘草素濃度為0.2mmol/L。見圖1。

圖1 不同濃度甘草素對A549細胞增殖的抑制作用Figure 1 Inhibitory effect of different concentrations of liquiritigenin on the proliferation of A549 cells

2.2 甘草素對A549細胞放療敏感性的影響隨著放射劑量增加，空白組與甘草素組A549細胞SF均逐漸降低，甘草素組細胞SF較空白組顯著降低（P＜0.05）。甘草素組A549細胞的SERD0和SERDq分別為1.27、1.54，放射增敏比＞1。結果表明，甘草素可以增強A549細胞的放療敏感性。照射劑量為4 Gy時，A549細胞SF接近0.5，因此后續研究選用放射線劑量4 Gy作為照射劑量。具體結果見圖2、表2。

圖2 不同劑量放射線照射后細胞存活曲線Figure 2 Cell survival curve after different doses of radiation

表2 單擊多靶模型參數比較Table 2 Comparison of single-click multi-target model parameters

2.3 各組A549細胞相對活力比較各組細胞相對活力組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，甘草素組細胞相對活力降低，miR-21 mimics組細胞相對活力升高（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組細胞相對活力升高（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組細胞相對活力升高（P＜0.05）；與miR-21 mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics組細胞相對活力降低（P＜0.05）。結果表明，甘草素可減弱miR-21 mimics促進A549細胞增殖的作用。具體結果見表3。

表3 各組A549細胞相對活力比較Table 3 Comparison of the relative viability of A549 cells in various groups （±s；n=5）

表3 各組A549細胞相對活力比較Table 3 Comparison of the relative viability of A549 cells in various groups （±s；n=5）

①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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2.4 各組A549細胞凋亡率比較細胞凋亡率組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，甘草素組細胞凋亡率升高，miR-21 mimics組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics

組細胞凋亡率升高（P＜0.05）。結果表明，甘草素可增加miR-21 mimics抑制A549細胞凋亡的作用。具體結果見表4、圖3。

圖3 各組A549細胞凋亡情況比較Figure 3 Comparison of A549 cell apoptosis in various groups

表4 各組A549細胞凋亡率比較Table 4 Comparison of apoptosis rate of A549 cells in various groups （±s；n=3）

表4 各組A549細胞凋亡率比較Table 4 Comparison of apoptosis rate of A549 cells in various groups （±s；n=3）

①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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2.5 各組A549細胞miR-21和MEG2 mRNA相對表達量比較各組細胞miR-21和MEG2 mRNA相對表達量組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，甘草素組miR-21相對表達量降低，MEG2 mRNA相對表達量升高，miR-21 mimics組miR-21相對表達量升高，MEG2 mRNA相對表達量降低（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組miR-21相對表達量升高，MEG2 mRNA相對表達量降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組miR-21相對表達量升高，MEG2 mRNA相對表達量降低（P＜0.05）；與miR-21mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics組miR-21相對表達量降低，MEG2 mRNA相對表達量升高（P＜0.05）。結果表明，miR-21可能與MEG2 mRNA表達相關。具體結果見表5。

表5 各組A549細胞miR-21和MEG2 mRNA相對表達量比較Table 5 Comparison of the relative expression levels of miR-21 and MEG2 mRNA in A549 cells of various groups （±s；n=3）

表5 各組A549細胞miR-21和MEG2 mRNA相對表達量比較Table 5 Comparison of the relative expression levels of miR-21 and MEG2 mRNA in A549 cells of various groups （±s；n=3）

①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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2.6miR-21與MEG2的靶向關系通過數據庫預測miR-21與MEG2的靶向關系，結果顯示，miR-21可以結合MEG2的3’-UTR區域，見圖4-A。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與共轉染miR-21 mimics-NC、MEG2 3’-UTR野生型載體的A549細胞比較，共轉染miR-21 mimics、MEG2 3’-UTR野生型載體的細胞熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），與共轉染miR-21 mimics-NC、MEG2 3’-UTR突變型載體的A549細胞比較，共轉染miR-21 mimics、MEG2 3’-UTR突變型載體的細胞熒光素酶活性無明顯變化。結果表明，miR-21直接靶向調控MEG2表達。具體結果見圖4-B。

圖4 miR-21與MEG2的靶向關系Figure 4 Targeting relationship between miR-21 and MEG2

2.7 各組A549細胞MEG2蛋白相對表達量比較各組A549細胞MEG2蛋白相對表達量組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，甘草素組MEG2蛋白相對表達量升高，miR-21 mimics組MEG2蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與甘草素組比較，miR-21 mimics組、甘草素+miR-21 mimics組MEG2蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics-NC組比較，miR-21 mimics組MEG2蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與miR-21 mimics組比較，甘草素+miR-21 mimics組MEG2蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。表明甘草素可減弱miR-21對MEG2的抑制作用。具體結果見圖5、表6。

表6 各組A549細胞MEG2蛋白相對表達量比較Table 6 Comparison of protein relative expression level of MEG2 in A549 cells of various groups（±s；n=3）

表6 各組A549細胞MEG2蛋白相對表達量比較Table 6 Comparison of protein relative expression level of MEG2 in A549 cells of various groups（±s；n=3）

①P＜0.05，與對照組比較；②P＜0.05，與甘草素組比較；③P＜0.05，與miR-21 mimics-NC組比較；④P＜0.05，與miR-21 mimics組比較

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圖5 各組A549細胞MEG2蛋白表達比較Figure 5 Comparison of MEG2 protein expression in A549 cells of various groups

3 討論

目前，我國每年非小細胞肺癌（NSCLC）新發病例約73.3萬，死亡病例約59.1萬[10]。NSCLC發生發展過程中原癌基因表達下調和抑癌基因表達上調，基因異常表達及長期積累引起細胞增殖凋亡調控失常，細胞異質惡性增殖導致NSCLC發生[11-12]。NSCLC病情進展隱蔽，多數患者確診時已處于中晚期，多失去手術治療的機會。非手術患者應首先考慮進行常規或立體定向放射治療[13]。放射治療是通過電離輻射在腫瘤細胞中產生自由基，損傷癌細胞基因組DNA，細胞周期停滯，損傷修復失敗直接或間接導致細胞凋亡[14]。腫瘤細胞對致死性損傷修復的能力高低是導致腫瘤細胞產生放療耐受性的機制之一，NSCLC患者的放療抵抗性極大降低了放療效果[15]。因此，尋找安全、低毒、高效及副作用小的放療增敏藥物對提高放療效果意義重大。

目前，甘草素在多種腫瘤細胞中的抗腫瘤作用及放療增敏作用已被證實[16-17]，但應用于NSCLC放療增敏方面鮮有報道。為探討甘草素對NSCLC細胞放療敏感性的影響及其可能的作用機制，本研究以NSCLC細胞A549為實驗對象，使用不同濃度甘草素處理A549細胞，結果顯示不同濃度甘草素均對A549細胞具有增殖抑制作用。本研究采用克隆形成實驗檢測A549細胞放療增敏作用，CCK-8實驗檢測A549細胞增殖活力及流式細胞術檢測A549細胞凋亡情況，結果顯示，使用甘草素后的SERD0和SERDq分別為1.27、1.54，且甘草素組A549細胞相對活力較對照組下降，凋亡率升高。結果表明甘草素可抑制A549細胞增殖，促進A549細胞凋亡并增強其放療敏感性。

微小RNA（microRNA，miRNA）是18～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，可在轉錄后水平調節基因表達，參與多種生理和病理過程，包括細胞增殖、凋亡、分化、發育及癌細胞浸潤等[18]。既往研究顯示，通過與輻射相關信號轉導途徑中的關鍵成分如上游受體、中游換能器和下游效應因子等相互作用，miRNA可有效激活細胞核中DNA損傷反應基因和細胞周期相關基因的表達，調節腫瘤細胞的輻射反應和放射敏感性[19]。Liu等[20]研究表明，miR-21是通過第10號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白（PTEN）/蛋白激酶B（Akt）途徑調節電離輻射誘導肺上皮細胞上皮-間質轉化的關鍵因子。Liu等[21]研究表明，過表達miR-21可降低晚期宮頸癌通過SMAD7對放化療的敏感性，提示miR-21具有放療增敏作用。miRNA可通過調控下游靶基因，發揮相應生物學作用。Bao等[22]研究表明，miR-21通過直接靶向MEG2促進結直腸癌細胞的增殖、侵襲并抑制凋亡。饒鐘鳴等[23]研究顯示，miR-21可通過靶向抑制MEG2表達，參與調節肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡過程。本研究將A549細胞轉染miR-21 mimics誘導miR-21過量表達，MEG2 mRNA和蛋白相對表達量降低，細胞相對活力升高，凋亡率降低，再經甘草素干預后miR-21相對表達量降低，MEG2 mRNA和蛋白相對表達量升高，細胞相對活力降低，凋亡率升高，逆轉了miR-21表達上調的作用效果，雙熒光素酶報告基因結果表明miR-21直接靶向MEG2，提示甘草素可能通過miR-21/MEG2軸抑制NSCLC細胞增殖，誘導細胞凋亡和增強其放療敏感性。

綜上所述，甘草素可以抑制NSCLC細胞增殖，誘導凋亡，增強其放療敏感性，可能是通過調控miR-21對MEG2轉錄和翻譯的抑制發揮作用。本研究結果可為甘草素相關藥物的研發及應用于NSCLC的臨床治療提供理論依據。