基于“氣血兩清”理論探討浮萍-紫草對銀屑病模型小鼠皮膚屏障功能的影響

袁佳晴， 朱新景， 王星星， 鄭琳琳， 景慧玲

（1.陜西中醫藥大學，陜西咸陽 712046；2.西安市中醫醫院，陜西西安 710021）

銀屑病（psoriasis）是一種由免疫介導的慢性炎癥性皮膚病，主要表現為紅斑、浸潤、鱗屑，累及人群較廣[1-2]。有研究證實，銀屑病與關節炎、心血管炎有相關性，危害較大[3]，臨床上西醫常規治療效果不甚理想，復發率高，嚴重影響了患者的身心健康[4]。而中醫藥治療該病具有一定的優勢。浮萍-紫草是疏風清熱涼血中藥藥對，臨床常用于該病的治療。本課題組前期已發現紫草的藥效成分紫草素可通過Hippo-Yap信號通路在銀屑病的早期發揮作用[5]。因此，本研究通過動物實驗，基于“氣血兩清”理論進一步探討“浮萍-紫草”對銀屑病模型小鼠皮膚屏障功能的影響，以期為其臨床推廣應用提供基礎。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級6～8周齡Balb/c小鼠120只，體質量（18±2）g，雌雄各半，購于第四軍醫大學動物實驗中心，動物質量合格證號：SCXK（陜）2018-001。飼養于西安醫學院第二附屬醫院實驗室，室溫22～25℃，相對濕度40%～60%，自由飲水進食。適應1周后進行實驗。

1.2 藥物、試劑與儀器木犀草素（標準品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司提供，批號：B20888）；紫草素（標準品，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司提供，批號：B21682）；阿維A膠囊（重慶華邦制藥有限公司產品，批號：H20010126）；咪喹莫特乳膏（四川明欣藥業有限公司，批號：H20030128）。10%甲醛溶液（太原市衛星制藥有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。GPSkin Barrier檢測儀（北京安德普泰醫療科技有限公司）；CX31型顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

1.3 分組、造模與給藥將120只小鼠隨機分為12組，即空白組，模型組，陽性對照組，浮萍低、中、高濃度組，紫草低、中、高濃度組，浮萍-紫草低、中、高濃度組，每組10只。

造模方法[6-7]：造模前1 d，除空白組外，其他各組小鼠脊背兩側均進行脫毛處理，面積約為3 cm×3 cm。次日10∶00，在脫毛區域外涂5%咪喹莫特乳膏42 mg，1次/d，連續7 d。空白組僅做脫毛處理。

給藥與造模同時進行。各組小鼠于每日16∶00給藥：空白組、模型組灌胃生理鹽水；陽性對照組灌胃阿維A的蒸餾水混懸液；浮萍低、中、高濃度組分別灌胃20、40、80 mg/kg木犀草素標準品的蒸餾水混懸液；紫草低、中、高濃度組分別灌胃20、40、80 mg/kg紫草素標準品的蒸餾水混懸液；浮萍-紫草低、中、高濃度組分別灌胃20、40、80 mg/kg木犀草素與紫草素標準品混懸液[8]。1次/d，連續7 d。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 銀屑病面積及嚴重指數（PASI）評分 采用PASI評分標準[9]，對皮膚癥狀從紅斑、浸潤、鱗屑3項指標進行評價，以0～4分進行記分：無癥狀，計0分；輕度，計1分；中度，計2分；重度，計3分；極重度，計4分。將各指標積分相加得到總積分。

1.4.2 皮膚組織病理學觀察 造模與給藥結束后，頸椎脫臼處死各組小鼠，剪取背部皮損處組織，用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，進行HE染色，光鏡下觀察皮損組織的病理表現。

1.4.3 皮膚屏障功能檢測 分別于干預的第1、3、7天，采用GPSkin Barrier檢測儀測量小鼠經表皮水分丟失（TEWL）、角質層含水量（SCH）、皮膚濕度。

1.5 統計方法采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用重復測量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠皮膚銀屑病面積及嚴重指數（PASI）比較圖1結果顯示：干預第7天，與模型組比較，各治療組PASI評分均有所降低，且與陽性對照組比較，浮萍高濃度組、紫草各濃度組、浮萍-紫草各濃度組改善更明顯（P＜0.05）。浮萍高濃度組、紫草高濃度組、浮萍-紫草高濃度組PASI評分于干預第7天低于相應中、低濃度組（P＜0.05）。可見浮萍、紫草、浮萍-紫草高濃度效果明顯，且浮萍-紫草組效果優于浮萍組、紫草組。

圖1 各組小鼠皮膚銀屑病面積及嚴重指數（PASI）評分變化Figure 1 Comparison of changes of PASIscore of mice in various groups

圖2 結果顯示：干預第7天，空白組無變化，其他各組都出現不同程度的紅斑、浸潤、鱗屑。與模型組比較，各治療組的紅斑、浸潤、鱗屑都相對減輕。與陽性對照組比較，中、高濃度的浮萍組、紫草組、浮萍-紫草組的紅斑、浸潤、鱗屑均有不同程度的減輕。在浮萍組中，高濃度組的皮損較低、中濃度組減輕；在紫草組中，高濃度組的皮損較低、中濃度組減輕；在浮萍-紫草組中，高濃度組的皮損較低、中濃度組減輕。各中藥組的比較中，浮萍-紫草組皮損改善情況最優、效果更明顯。

圖2 各組小鼠干預第7天皮膚外觀差異比較Figure 2 Comparison of mouse skin appearance of various groups on day 7 of intervention

2.2 各組小鼠皮膚組織病理表現比較圖3結果顯示：空白組小鼠皮膚組織結構清楚，層次分明，表皮厚度正常；模型組小鼠可見皮損類銀屑病樣，表現為表皮明顯增厚，伴角化不全，棘層增厚，顆粒層明顯減少，表皮突延長，真皮層可見乳頭水腫、血管擴張，伴見炎性細胞浸潤；與模型組比較，各給藥組小鼠皮損處表皮可見不同程度變薄，角化不全明顯減少，炎性細胞浸潤也減少，其中，浮萍-紫草高濃度組改善程度最為明顯，其次為紫草高濃度組和浮萍高濃度組。

圖3 各組小鼠皮膚組織病理表現比較（HE染色法，×400）Figure 3 Comparison of changes of mouse skin lesions in various groups（by HE staining，×400）

2.3 各組小鼠不同時間經表皮水分流失（TEWL）比較表1結果顯示：干預第1天，各組TEWL比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠不同時間經表皮水分流失（TEWL）比較Table 1 Comparison of transepidermal water loss（TEWL）of mice in various groups at different intervention time [±s，g/（h·m2）]

表1 各組小鼠不同時間經表皮水分流失（TEWL）比較Table 1 Comparison of transepidermal water loss（TEWL）of mice in various groups at different intervention time [±s，g/（h·m2）]

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較；⑤P＜0.05，與陽性對照組比較

?

干預第4天，與空白組比較，模型組TEWL升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），而陽性對照組、浮萍中濃度組、紫草中濃度組TEWL降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組TEWL均降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

干預第7天，與空白組比較，模型組TEWL升高，但差異無統計學意義（P＞0.05），而各給藥組TEWL均降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TEWL均降低，差異均有統計學意義（P＜0.01），其中，浮萍-紫草高濃度組TEWL明顯低于陽性對照組（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠不同時間角質層含水量（SCH）比較表2結果顯示：干預第1天，與空白組比較，浮萍高濃度組SCH升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠不同時間角質層含水量（SCH）比較Table 2 Comparison of stratum corneum hydration（SCH）of mice in various groups at different intervention time （±s，%）

表2 各組小鼠不同時間角質層含水量（SCH）比較Table 2 Comparison of stratum corneum hydration（SCH）of mice in various groups at different intervention time （±s，%）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，與陽性對照組比較

?

干預第4天，各組小鼠SCH較干預第1天均有所下降。與空白組比較，模型組，浮萍高濃度組，紫草中、高濃度組，浮萍-紫草中、高濃度組小鼠SCH降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組，浮萍高濃度組，紫草低、中、高濃度組，浮萍-紫草中、高濃度組SCH升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且浮萍低濃度組，浮萍-紫草低、中、高濃度組SCH高于陽性對照組（P＜0.05或P＜0.01）。

干預第7天，除模型組外，其余各組SCH含量較第4天均有所升高。與空白組比較，模型組，紫草低、高濃度組SCH升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組，浮萍高濃度組，紫草高濃度組，浮萍-紫草中、高濃度組SCH升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與陽性對照組比較，紫草低、中濃度組，浮萍-紫草低濃度組SCH升高，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 各組小鼠不同時間皮膚濕度比較表3結果顯示：干預第1天，各組皮膚濕度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組小鼠不同時間皮膚濕度比較Table 3 Comparison of mouse skin moisture of various groups at different intervention time （±s，%）

表3 各組小鼠不同時間皮膚濕度比較Table 3 Comparison of mouse skin moisture of various groups at different intervention time （±s，%）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

?

干預第4天，各組皮膚濕度較干預第1天均有所降低。與空白組比較，模型組，浮萍中濃度組，紫草低、中濃度組，浮萍-紫草低、中濃度組皮膚濕度皮膚濕度降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組，浮萍低、中、高濃度組，紫草低、高濃度組，浮萍-紫草高濃度組升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；各治療組間皮膚濕度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

干預第7天，除模型組外，其余各組皮膚濕度較干預第4天均有所升高。與模型組比較，浮萍-紫草低、高濃度組皮膚濕度升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

銀屑病在中醫學中稱為“白疕”，多由于素體血中蘊熱，復感風熱毒邪，或恣食腥發動風之物，或情志內傷，五志化火，兩陽相合，內不能疏泄，燔灼血液，充斥肌膚，發為白疕[10]。因此，中醫辨證治療銀屑病的主要治法是清熱涼血解毒、祛風散邪止癢。在臨床治療中，氣血兩清是較為常用的方法，浮萍紫草藥對出自名老中醫施今墨[11]，二者可氣血雙清，透疹解毒，祛風止癢。藥對浮萍-紫草中：浮萍味辛，性寒，入肺經達皮膚，體輕氣浮，偏走氣分，升散力強；紫草味甘，性寒，色紫質滑，入心、肝經，專入血分，長于清血分熱毒。浮萍-紫草二藥伍用，一氣一血，氣血兩清，透疹解毒，祛風止癢[11]。

現代醫學中，紫草抗銀屑病作用主要因其主要成分紫草素可抑制表皮角質形成細胞增殖、抑制炎癥反應、抑制血管增生[12-13]。本課題組前期在“從血論治”的理論指導下，對紫草的抗銀屑病作用機制進行了研究[14]。浮萍的主要成分是木犀草素、芹菜素[15]，查閱文獻發現浮萍能夠抗氧化、抗衰老、止癢[16-17]，其主要成分木犀草素可抗氧化、抗炎[18]、降低VEGF的表達，抗黑素瘤[19]。為有效地驗證浮萍與紫草的現代藥理研究及其藥對對銀屑病的治療作用機制，故選擇浮萍、紫草的主要活性成分作為研究對象，觀察其對銀屑病皮損區的皮膚屏障修復作用機制，也為后期的細胞實驗奠定了一定的基礎。本研究的直接指標皮損結果顯示：模型組存在表皮增厚、棘層增厚、顆粒層減少、炎性細胞減少等銀屑病樣的皮損，而浮萍-紫草藥對能使銀屑病皮膚表皮不同程度變薄，角化不全明顯減輕，炎性細胞浸潤也減少，表明浮萍-紫草藥對可改善銀屑病小鼠的皮損。

本研究于干預第1、4、7天時，計算PASI評分并檢測TEWL、SCH、皮膚濕度，探討浮萍-紫草藥對對銀屑病小鼠皮膚屏障功能的影響。PASI結果顯示：干預第7天，除模型組外，與陽性對照組比較，浮萍組、紫草組、浮萍-紫草組的PASI評分均降低，表明浮萍組、紫草組、浮萍紫草組對皮損改善作用優于陽性對照組。且在浮萍組、紫草組、浮萍-紫草組中，浮萍、紫草聯用治療效果優于單藥使用。

有研究證實，銀屑病皮膚屏障功能缺損[20]。本研究結果顯示：模型組TEWL顯著升高，SCH明顯降低，表明銀屑病存在皮膚屏障功能的缺損。而使用浮萍-紫草藥對可以不同程度地改善銀屑病受損皮膚屏障功能，提示浮萍-紫草藥對可減少皮膚SCH，增加角質層的含水量，提高表皮濕度，從而修復屏障。

綜上所述，改善皮膚屏障功能是預防治療銀屑病的關鍵步驟。本研究通過動物實驗也證實了中藥浮萍、紫草分別或聯合均能改善小鼠銀屑病模型的皮損，對銀屑病的皮膚屏障功能有修復作用，且藥對聯合改善作用更加顯著，體現了“氣血兩清”。這對于今后銀屑病的診治有一定的指導意義。后期將以皮膚屏障等相關因子、免疫相關因子為切入點進一步探討浮萍-紫草治療銀屑病的相關機制，以為其今后的臨床工作提供基礎理論支持。