血必凈對大鼠睪丸扭轉/復位缺血再灌注損傷的修復作用

施源， 李宏軍， 王君君， 李堅， 鄧新超， 魯密， 張輝

（武漢市第八醫院，湖北武漢 430010）

睪丸扭轉是泌尿外科常見的急癥，也是男性生殖器損傷的原因之一，其表現為睪丸連同周圍的附睪以及精索發生扭轉。睪丸扭轉，精索內血流不暢和睪丸缺血，引起睪丸生殖細胞凋亡壞死，可致患者生殖能力受損或缺失[1-2]。一經確診為睪丸扭轉，臨床上需盡早通過手術方式進行睪丸扭轉復位，恢復睪丸血液流動，減輕睪丸損傷[3-4]。但睪丸扭轉復位是缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷的病理生理過程，仍可促使睪丸生殖細胞凋亡增多，導致睪丸萎縮和精子生發功能障礙[1，4-5]，目前尚無理想的防治方法。血必凈注射液（以下簡稱“血必凈”）是一種中藥復方制劑，具有抗氧化、抗炎、改善組織微環境、減輕組織細胞損傷等多種功效[6-7]。有研究報道，血必凈對I/R損傷具有一定的改善作用[7-9]；但血必凈對睪丸扭轉復位引起的I/R損傷的治療作用及機制尚不清楚。因此，本研究探討血必凈對大鼠睪丸I/R損傷的修復作用，以期為臨床治療睪丸扭轉/復位，減輕睪丸I/R損傷提供一定的理論參考，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只SPF級健康雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，購自湖北省疾控中心，動物質量合格證號：2000600023890。動物實驗于武漢華聯科生物技術有限公司動物研究中心進行，實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2018-0014。SD大鼠于SPF級條件下飼養，飼養溫度為22～26℃，相對濕度為50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2 藥物、試劑與儀器血必凈注射液（天津紅日藥業股份有限公司生產，批號：國藥準字Z20040033）；地塞米松（美國Sigma公司生產，貨號：D4902）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d UTP缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）和Toll樣受體4（TLR4）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國Bioswamp公司）；丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。DM1000正置顯微鏡、RM2235石蠟切片機（德國徠卡顯微系統有限公司）；TB-718D石蠟包埋機（湖北泰維科技實業有限公司）；AMR-100酶標分析儀、iCEN-24R離心機（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.3 分組、動物模型建立與給藥將40只大鼠隨機分為5組，即假手術組，模型組，血必凈低、高劑量組和地塞米松組，每組8只。所有SD大鼠經適應性飼養1周后進行正式實驗。除假手術組外，其他4組大鼠均采用Turner法[10]構建睪丸扭轉大鼠模型。造模方法：采用30 g/L戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，大鼠取仰臥位，固定四肢及頭部，采用常規備皮、酒精消毒，取左側陰囊切口約3 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及肉膜，將左側睪丸從切口擠出，游離左側睪丸，分離筋膜至附睪，結扎并切斷睪丸引帶，順時針扭轉睪丸720°，維持2 h后復位并于陰囊壁固定，關閉切口。睪丸由暗紅色變為鮮紅色則表明造模成功[11]。給藥方法：睪丸扭轉手術后，血必凈低、高劑量組大鼠分別對應給予腹腔注射血必凈注射液0.5、2 mL·kg-1·d-1；地塞米松組大鼠給予腹腔注射地塞米松0.5 mL·kg-1·d-1；假手術組采用相同的方式切開陰囊皮膚，不進行睪丸扭轉，術后注射相同體積的生理鹽水。每日給藥1次，連續給藥3 d。給藥3 d后，采用過度麻醉處死，收集各組大鼠血液和左側睪丸組織。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 HE染色法觀察睪丸組織損傷 將睪丸組織置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋后連續切片，切片厚度為4μm。水浴展片、高溫烤片、常規脫蠟至水后進行HE染色。最后采用封片處理，光學顯微鏡下觀察各組大鼠睪丸組織的病理組織學變化。

1.4.2 ELISA法檢測血清中炎性因子和TLR4水平 將收集的各組大鼠血液經離心后取血清，采用ELISA檢測試劑盒檢測血清中炎性因子（TNF-α、IL-1β）和TLR4水平，應用酶標儀檢測各樣本在450 nm波長處的光密度（OD）值，然后按照以標準品繪制的標準曲線計算出各指標水平。

1.4.3 生化檢測睪丸組織MDA、SOD水平 將收集的睪丸組織進行勻漿后，以900×g離心10 min，收集上清，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，采用羥胺法測定SOD水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。MDA檢測時應用酶標儀檢測532 nm波長處的OD值，SOD檢測時應用酶標儀檢測550 nm波長處的OD值，計算MDA和SOD的水平。

1.4.4 TUNEL染色法檢測睪丸組織中生殖細胞的凋亡水平 取各組大鼠睪丸組織的石蠟包埋塊，連續切片，切片厚度為4μm。經60℃烤片、二甲苯透明、梯度酒精水化后采用20μg/mL蛋白酶K工作液37℃孵育30 min。清洗后，加入50μL TUNEL反應混合液，將玻片置于濕盒中，37℃避光孵育60 min。清洗后，加入50μL轉化劑過氧化物酶（POD），繼續置于濕盒中37℃避光孵育30 min。清洗后，加入50μL二氨基聯苯胺（DAB）底物孵育10 min。繼而，蘇木素復染、脫水、透明，封片后光鏡下觀察。計算凋亡指數（500個細胞中凋亡細胞的數量）。

1.5 統計方法采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血必凈改善I/R損傷睪丸組織的病理學變化圖1結果顯示：假手術組睪丸曲細精管排列緊密，生殖細胞厚度正常，排列緊密有序，結構層次清晰；模型組睪丸曲細精管排列疏松，較為紊亂，細胞層次被破壞，生殖細胞明顯減少、脫落；血必凈低、高劑量組以及地塞米松組均可見生精細胞排列逐漸恢復正常，細胞層次逐漸清晰明了，少數腔內可見脫落細胞。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理學變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological changes of rat testis tissue in various groups（by HE staining，×200）

2.2 血必凈改善I/R損傷睪丸組織中MDA和SOD水平圖2結果顯示：與假手術組比較，模型組睪丸組織中SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，血必凈低、高劑量組睪丸組織中SOD水平明顯升高，MDA水平降低（P＜0.05）；地塞米松組與血必凈各劑量組趨勢一致（P＜0.05）。表明血必凈可抑制I/R損傷睪丸組織中的氧化應激反應。

2.3 血必凈抑制I/R損傷睪丸生殖細胞的凋亡圖3～圖4結果顯示：假手術組僅見少量的凋亡睪丸生殖細胞；而模型組睪丸中凋亡生殖細胞則明顯增多（P＜0.05），凋亡的生殖細胞深染，且凋亡細胞主要為初級精母細胞和精原細胞；與模型組比較，血必凈高劑量組和地塞米松組睪丸凋亡細胞明顯減少（P＜0.05）。表明血必凈能夠降低I/R損傷睪丸生殖細胞的凋亡水平。

圖3 各組大鼠睪丸組織凋亡生殖細胞分布比較（TUNEL染色，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of apoptotic germ cells in rat testis tissue of various group（by TUNEL staining，×200）

圖4 各組大鼠睪丸組織生殖細胞凋亡指數比較Figure 4 Comparison of apoptosis index of germ cells in rat testis tissue of various groups

A.SOD水平；B.MDA水平①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

2.4 血必凈降低睪丸扭轉大鼠血清中炎性因子水平圖5結果顯示：與假手術組比較，模型組TNF-α、IL-1β和TLR4水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，血必凈高劑量組以及地塞米松組TNF-α、IL-1β和TLR4水平均顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

睪丸扭轉可導致睪丸組織缺血，需及時采取手術恢復睪丸供血，避免睪丸壞死致使患者喪失生殖能力[11]。然而，睪丸扭轉復位，也是一種I/R過程，缺血組織恢復供氧能夠引起氧自由基的過度表達，進而將細胞膜脂質物氧化形成有毒物質，如MDA，加劇缺血性睪丸的睪丸組織損傷[11-12]。睪丸I/R能夠激活炎癥信號通路，促進中性粒細胞從內皮細胞轉移至睪丸間質，增加活性氧的產生和炎性因子的釋放，導致生殖細胞功能障礙，誘導細胞凋亡[13]，睪丸生精作用受損，那么，如何有效治療睪丸扭轉/復位I/R是目前亟需解決的問題。

血必凈是由多種中草藥研制而成，包含紅花、當歸、川芎、丹參以及赤芍等，具有抗炎、增強免疫力、清熱解毒等作用[8-9]，對膿毒癥、重度肺炎、全身炎癥反應綜合征以及I/R損傷等均具有一定的保護作用[3，14-16]。有研究[14-15]顯示，在重癥肺炎患者或左心室I/R誘發急性肺損傷的動物模型中，血必凈能夠通過降低炎性介質細胞間黏附分子1（ICAM-1）和TNF-α的表達水平發揮抗炎的作用，且血必凈能夠上調抗氧化指標SOD活性，下調氧化產物MDA含量，進而發揮抗氧化作用[16]。SOD是一種清除氧自由基酶的活性劑，MDA是脂質過氧化物的最終產物，是反映氧自由基損傷的重要指標[17]。本研究結果顯示，模型組睪丸組織SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高，表明I/R狀態產生大量的活性氧自由基，介導了細胞膜中脂質過氧化反應，消耗了SOD。與模型組比較，血必凈組睪丸組織SOD水平顯著增加，MDA含量顯著減少，表明血必凈可抵抗氧自由基的損害，抑制睪丸I/R脂質過氧化反應。

A.TNF-α水平；B.IL-1β水平；C.TLR4水平①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較

有研究[18]顯示，TLR4是模式識別受體家族成員之一，能夠誘導激活核因子kappaB（NF-κB）信號通路，進而促進炎癥因子TNF-α、IL-1和IL-6等的表達，促進炎癥反應。這些炎癥因子又會產生大量的活性氧自由基、蛋白水解酶等，對組織細胞造成一定的毒性損傷。細胞凋亡是一種由多種因素誘發的程序性凋亡過程，I/R與細胞凋亡有著十分緊密的關系[19-20]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組睪丸組織病理損傷加重，血清中TNF-α、IL-1β和TLR4炎癥因子水平上調，凋亡細胞數增多，表明睪丸I/R對生殖細胞造成了損害。而血必凈能夠明顯改善睪丸組織的病理損傷，減少凋亡的生殖細胞數量，同時下調炎性因子TNF-α、IL-1β和TLR4的水平，表明血必凈對I/R睪丸組織具有保護作用。

地塞米松（Dexamethasone）是一種合成的糖皮質激素，作為有效的抗炎藥，被臨床廣泛應用于治療炎癥和自身免疫性疾病，包括風濕性關節炎、炎癥性休克和哮喘等[21]。有研究[22]顯示，在腎I/R動物模型中，地塞米松能夠通過高遷移率族蛋白1（HMGB1）/TLR4、NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路抑制炎性因子TNF-α、IL-1β的表達。本結果研究顯示，血必凈與地塞米松治療效果相當。

綜上所述，血必凈可通過改善睪丸I/R后睪丸病理損傷，減少受損組織中生殖細胞的凋亡，降低組織中氧化應激反應，抑制炎癥因子的表達，從而發揮大鼠睪丸扭轉/復位I/R損傷的修復作用。這為臨床應用血必凈治療睪丸扭轉，減輕患者的睪丸損傷提供一定的理論依據。