大蒜素抑制慢性腎衰竭大鼠炎癥反應

沈金峰， 胡良偉， 胡芳， 晏子友， 李云生， 鐘森， 朱慧萍

（1.溫嶺市第一人民醫院，浙江溫嶺 317500；2.江西中醫藥大學，江西南昌 330006）

慢性腎衰竭（chronic renal failure）是各種慢性腎病發展至后期的一組臨床綜合征，主要表現為腎功能下降，代謝產物蓄積，水、電解質及酸堿平衡紊亂[1]。誘發和加重慢性腎衰竭的病因包括傳統因素及非傳統因素，而炎癥是慢性腎衰竭加重的非傳統因素之一[2]。有研究發現，慢性腎衰竭患者血清白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和轉化生長因子β1（TGF-β1）較正常人升高，且與腎功能呈一定相關性[3]。Toll樣受體/髓樣細胞分化因子88/核轉錄因子kappaB（TLR4/MyD88/NF-κB）是介導機體炎性反應的重要信號通路[4]。有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB介導炎癥反應參與慢性腎衰竭的發生與發展[5]。

慢性腎衰竭屬于中醫學“關格”“癃閉”“水腫”“腎風”“腎勞”等范疇[6]，病機總屬正虛邪實。大蒜為藥食同源的百合科蔥屬植物，以鱗莖入藥，性溫、味辛，歸脾、胃、肺經，在疾病防治方面的應用已有幾千年的歷史[7]，《本草綱目》記載其具有“能達下焦，消水，利大小便……能通幽門，治關格不通”的功效。大蒜素是一種從大蒜鱗莖中獲得的二烯丙基三硫化物，收錄于2015年版《中國藥典》。現代藥理學研究表明，其具有抗心肌纖維化、降脂、抗腫瘤、抗老年癡呆、抗炎、抗菌、抗氧化、抗感染、保護心血管、保護腎臟等作用[8-11]。既往相關研究發現，大蒜素可以改善慢性腎衰竭大鼠腎功能，抑制腎臟組織病變[12]。那么，大蒜素是否可以通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路介導的炎癥反應改善慢性腎衰竭大鼠腎功能、修復腎損害？基于此，本課題組開展了此次研究，通過觀察大蒜素對慢性腎衰竭大鼠腎組織TLR4/MyD88/NF-κB及其下游炎癥因子的影響，探討大蒜素對慢性腎衰竭進展的干預機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物無特定病原體（SPF）級成年雌性大鼠50只，體質量180～200 g，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心，動物質量合格證號：SCSK（浙）20180003。適應1周，尿蛋白陰性者方可使用。飼養環境：溫度（22±3）℃、相對濕度（55±10）%。本動物實驗方案已通過溫嶺市第一人民醫院實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥物、試劑與儀器大蒜素分子式為C6H9S3，結構式為CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2，購自上海禾豐制藥有限公司，生產批號：8239402，規格：30 mg/2 mL。白細胞介素1β（IL-1β）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒（美國R&D systems公司）；NF-κB抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；MyD88抗體、TLR4抗體（美國Abcam公司）。全自動生化分析儀（Siemens公司，型號：ADVIA2400）；酶標分析儀（TECAN公司，型號：sunrise）；臺式離心機（江蘇湘儀公司，型號：L500）；洗板機（SYM-Bio Life Science公司，型號：Egate2310）。

1.3 動物分組、造模與給藥將50只大鼠按體質量隨機分為假手術組，模型組，大蒜素低、中、高劑量組，每組10只。模型組，大蒜素低、中、高劑量組大鼠采用5/6腎切除法構建慢性腎衰竭模型[13]。方法：以10%水合氯醛（350 mg·kg-1）麻醉大鼠，使大鼠仰臥暴露背部左腎區，腹部左側切口開腹后暴露左腎，游離出左腎；用聚乙醇酸縫合線結扎左腎上下兩極（占腎臟體積各約1/3）后，眼科剪剪去上下極，同時用明膠海綿壓迫止血2 min；切除完畢后將殘腎復位至腎窩，再將臟器及腹膜覆蓋于上，逐層縫合腹膜和皮膚。1周后再次手術，取右側腹部切口摘除右腎。假手術組僅同期進行2次手術，但不切除腎臟。通過評估模型大鼠腎功能異常及病理變化的結果來判斷造模成功與否[13]。術后第8周起開始灌胃。大蒜素的大鼠用藥劑量按照沈映君教授主編的《中藥藥理學》[14]中藥實驗用藥劑量方法進行換算，10倍于臨床用藥的劑量折算為等效劑量給藥。大蒜素高、中、低劑量組分別給予10、20、40 mg·kg-1·d-1大蒜素灌胃，假手術組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續4周。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 一般情況觀察 每日觀察記錄大鼠的毛發、攝食量、活動、精神狀態及體質量變化，每周測量尿量、24 h尿蛋白。

1.4.2 腎功能檢測 應用全自動生化分析儀檢測血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）的含量。

1.4.3 ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α

水平 分別按照相應指標的ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.4.4 腎臟組織病理學觀察 沿腎蒂剪下殘余腎臟，以體積分數10%甲醛溶液固定后，流水沖洗過夜，常規脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，展片，烤片，再進行蘇木素-伊紅（HE）和馬松（Masson）染色，光鏡下觀察腎臟組織的改變。

1.4.5 采用qRT-PCR法測定腎組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達（1）應用TaKaRa公司提供的RNAisoPlus提取腎組織總RNA。（2）RNA質量檢測。通過紫外吸收法：①濃度測定；②純度檢測。（3）樣品cDNA合成：按照逆轉錄試劑盒配制反應體系，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，于-80℃保存。（4）利用熒光定量PCR試劑盒進行PCR反應后上機。

TLR4上游引物序列為5’-GGTGCGACATCCA TACAAT-3’，下游引物序列為5’-TAGGACAGTC AGGGAGGATA-3’，片段長度為170 bp；MyD88上游引物序列為5’-CCCTGGGCAAAGACTAAGAG C-3’，下游引物序列為5’-AAGAAGGTGTCCGAG GATGGT-3’，片段長度為130 bp；NF-κB上游引物序列為5’-GCCCATTGCCTCCAACTTAAA-3’，下游引物序列為5’-ATATCTCTTTCTGACCTTGTCAC-3’，片段長度為108 bp。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性45 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，6個循環；92℃變性45 s，68℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃擴展延伸10 min。以GAPDH為內參，運用2-ΔΔCt法計算各目的基因的mRNA的相對表達量。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達 收集處理后的腎組織，在冰上用放射免疫沉淀分析（RIPA）細胞裂解液裂解，提取蛋白。通過二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸10 min，取40μg蛋白上樣，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白條帶電轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育2 h，洗膜后采用電化學發光（ECL）法使蛋白條帶顯色，以β-actin為內參，應用ImageJ分析軟件對各組條帶的灰度值進行分析。

1.5 統計方法采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能指標比較圖1結果顯示：與假手術組比較，模型組血清SCr、BUN水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組血清SCr、BUN水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.2 各組大鼠炎癥指標比較圖2結果顯示：與假手術組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較Figure 2 Comparison of serum IL-1β，IL-6，TNF-αlevels in rats of various groups

2.3 各組大鼠腎組織病理變化比較圖3、圖4結果顯示：假手術組腎小球、腎小管結構正常，系膜細胞和基質無增生，腎間質無炎性細胞浸潤及纖維化；模型組腎小球體積增大，系膜細胞和基質增生，腎小管上皮細胞空泡樣變，基底膜增厚、腎間質大量炎性細胞浸潤及纖維化；大蒜素低、中、高劑量組腎小球損傷減輕，系膜細胞及基質增生減輕，腎小管上皮細胞空泡變性減輕，腎間質炎性細胞減少、纖維化減輕，其中，大蒜素高劑量組病理損傷最輕。

圖3 各組大鼠腎組織HE染色結果比較（×200）Figure 3 Comparison of HE staining results of rat renal tissues in various groups（×200）

圖4 各組大鼠腎組織Masson染色結果比較（×200）Figure 4 Comparison of Masson staining results of rat renal tissues in various groups（×200）

2.4 各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達比較圖5結果顯示：與假手術組比較，模型組腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖5 各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達比較Figure 5 Comparison of protein expression of TLR4，MyD88，NF-κB in renal tissues of rats in various groups

2.5各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κBmRNA

表達比較圖6結果顯示：與假手術組比較，模型組腎組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達水平明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組腎組織TLR4、MyD88、NF-κBmRNA表達水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖6 各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達比較Figure 6 Comparison of mRNA expression of TLR4，MyD88，NF-κB in renal tissues of rats in various groups

3 討論

慢性腎衰竭是各類慢性腎臟病終末階段。慢性腎衰竭病理主要表現為間質炎癥細胞的浸潤和炎性介質的釋放，成纖維細胞的活化和增殖，以及過量細胞外基質的沉積[15]，提示慢性腎衰竭屬于一種炎癥疾病。炎癥是誘發和加重慢性腎衰竭的因素之一。腎固有細胞在病理過程中，不僅是損傷的被動受害者，還主動參與調節腎臟免疫炎癥反應[16-17]。當腎組織受到損傷時，腎固有細胞表型發生轉化，釋放一系列炎性介質與細胞因子等，進一步擴大炎癥反應，與此同時還激活血小板源性生長因子（PDGF）、轉化生長因子β1（TGF-β1）促進腎間質纖維化，導致炎癥瀑布效應，致使腎臟持續性損傷[18]。我們既往研究發現，慢性腎衰竭患者C-反應蛋白（CRP）、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥指標升高，且炎癥指標水平與腎功能呈一定的相關性，即腎功能下降越明顯，炎癥指標相對越高，進一步提示慢性炎癥反應參與了慢性腎衰竭的發生發展[19]。

5/6腎切除大鼠模型是制備慢性腎衰竭的經典模型[13]。本實驗采用5/6腎切除法制備慢性腎衰竭大鼠模型，通過造成有效腎單位減少，形成“三高”（高壓力、高濾過、腎小球高灌注）狀態，最終構建成功以腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質纖維化為病理特點的動物疾病模型，其與臨床慢性腎衰竭疾病發展極其相似。研究發現，5/6腎切除模型同時存在免疫異常和微炎癥狀態[20]。

本研究發現，5/6腎切除模型大鼠血清SCr、BUN水平明顯升高，給予大蒜素治療后SCr、BUN水平有所下降，表明大蒜素具有保護腎臟的作用。還發現，模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，表明慢性腎衰竭大鼠處于慢性炎癥狀態；給予大蒜素治療后升高的IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降，結合大鼠腎組織病理變化來看，大蒜素亦可減輕5/6腎切除大鼠腎損害，降低其炎癥細胞浸潤，表明大蒜素可以抑制慢性腎衰竭大鼠炎癥反應，本結果進一步驗證了大蒜素具有保護腎功能的作用。

TLR4是TLRs家族成員之一，主要參與感染性和自身免疫疾病的模式識別受體。TLR4在感染反應中識別PAMPs，進而通過細胞內信號轉導途徑激活先天免疫防御，最終釋放促炎細胞因子和趨化因子[21]。TLR4可以激活MyD88依賴性通路，誘導炎性細胞因子和輔助刺激因子的釋放[22]。腎組織中TLR4主要表達于腎小管上皮細胞、系膜細胞、血管內皮細胞，通過誘發炎癥反應，參與多種病因所致的腎纖維化[23]。在單側輸尿管梗阻（UUO）模型中，TLR4突變小鼠發生腎小球硬化和間質纖維化[24]。NF-κB主要表達于腎小球細胞和腎小管上皮細胞，TLR4經配體刺激后，可促進NF-κB活化，誘導NF-κB轉位到細胞核誘導特定基因的表達，進而誘導腎纖維化，同時調控IL-6、IL-1β等表達，促進炎癥反應[25-26]。

本研究結果顯示，5/6腎切除大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA表達水平明顯升高，用大蒜素干預后升高的TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA表達水平均下降，且大蒜素劑量越高，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA下降越明顯，提示大蒜素可以抑制TLR4、MyD88、NF-κB表達，且其作用效果呈劑量依賴性。

綜上所述，大蒜素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，減少炎癥因子的釋放，減輕慢性腎衰竭大鼠炎癥反應，進而延緩慢性腎衰竭進程。