大蒜素抑制慢性腎衰竭大鼠炎癥反應(yīng)

沈金峰， 胡良偉， 胡芳， 晏子友， 李云生， 鐘森， 朱慧萍

（1.溫嶺市第一人民醫(yī)院，浙江溫嶺 317500；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西南昌 330006）

慢性腎衰竭（chronic renal failure）是各種慢性腎病發(fā)展至后期的一組臨床綜合征，主要表現(xiàn)為腎功能下降，代謝產(chǎn)物蓄積，水、電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂[1]。誘發(fā)和加重慢性腎衰竭的病因包括傳統(tǒng)因素及非傳統(tǒng)因素，而炎癥是慢性腎衰竭加重的非傳統(tǒng)因素之一[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰竭患者血清白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）較正常人升高，且與腎功能呈一定相關(guān)性[3]。Toll樣受體/髓樣細(xì)胞分化因子88/核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（TLR4/MyD88/NF-κB）是介導(dǎo)機(jī)體炎性反應(yīng)的重要信號(hào)通路[4]。有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與慢性腎衰竭的發(fā)生與發(fā)展[5]。

慢性腎衰竭屬于中醫(yī)學(xué)“關(guān)格”“癃閉”“水腫”“腎風(fēng)”“腎勞”等范疇[6]，病機(jī)總屬正虛邪實(shí)。大蒜為藥食同源的百合科蔥屬植物，以鱗莖入藥，性溫、味辛，歸脾、胃、肺經(jīng)，在疾病防治方面的應(yīng)用已有幾千年的歷史[7]，《本草綱目》記載其具有“能達(dá)下焦，消水，利大小便……能通幽門，治關(guān)格不通”的功效。大蒜素是一種從大蒜鱗莖中獲得的二烯丙基三硫化物，收錄于2015年版《中國藥典》。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗心肌纖維化、降脂、抗腫瘤、抗老年癡呆、抗炎、抗菌、抗氧化、抗感染、保護(hù)心血管、保護(hù)腎臟等作用[8-11]。既往相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以改善慢性腎衰竭大鼠腎功能，抑制腎臟組織病變[12]。那么，大蒜素是否可以通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)改善慢性腎衰竭大鼠腎功能、修復(fù)腎損害？基于此，本課題組開展了此次研究，通過觀察大蒜素對(duì)慢性腎衰竭大鼠腎組織TLR4/MyD88/NF-κB及其下游炎癥因子的影響，探討大蒜素對(duì)慢性腎衰竭進(jìn)展的干預(yù)機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物無特定病原體（SPF）級(jí)成年雌性大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCSK（浙）20180003。適應(yīng)1周，尿蛋白陰性者方可使用。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22±3）℃、相對(duì)濕度（55±10）%。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過溫嶺市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 藥物、試劑與儀器大蒜素分子式為C6H9S3，結(jié)構(gòu)式為CH2=CH-CH2-S-S-S-CH2-CH=CH2，購自上海禾豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：8239402，規(guī)格：30 mg/2 mL。白細(xì)胞介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒（美國R&D systems公司）；NF-κB抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；MyD88抗體、TLR4抗體（美國Abcam公司）。全自動(dòng)生化分析儀（Siemens公司，型號(hào)：ADVIA2400）；酶標(biāo)分析儀（TECAN公司，型號(hào)：sunrise）；臺(tái)式離心機(jī)（江蘇湘儀公司，型號(hào)：L500）；洗板機(jī)（SYM-Bio Life Science公司，型號(hào)：Egate2310）。

1.3 動(dòng)物分組、造模與給藥將50只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，大蒜素低、中、高劑量組，每組10只。模型組，大蒜素低、中、高劑量組大鼠采用5/6腎切除法構(gòu)建慢性腎衰竭模型[13]。方法：以10%水合氯醛（350 mg·kg-1）麻醉大鼠，使大鼠仰臥暴露背部左腎區(qū)，腹部左側(cè)切口開腹后暴露左腎，游離出左腎；用聚乙醇酸縫合線結(jié)扎左腎上下兩極（占腎臟體積各約1/3）后，眼科剪剪去上下極，同時(shí)用明膠海綿壓迫止血2 min；切除完畢后將殘腎復(fù)位至腎窩，再將臟器及腹膜覆蓋于上，逐層縫合腹膜和皮膚。1周后再次手術(shù)，取右側(cè)腹部切口摘除右腎。假手術(shù)組僅同期進(jìn)行2次手術(shù)，但不切除腎臟。通過評(píng)估模型大鼠腎功能異常及病理變化的結(jié)果來判斷造模成功與否[13]。術(shù)后第8周起開始灌胃。大蒜素的大鼠用藥劑量按照沈映君教授主編的《中藥藥理學(xué)》[14]中藥實(shí)驗(yàn)用藥劑量方法進(jìn)行換算，10倍于臨床用藥的劑量折算為等效劑量給藥。大蒜素高、中、低劑量組分別給予10、20、40 mg·kg-1·d-1大蒜素灌胃，假手術(shù)組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 一般情況觀察 每日觀察記錄大鼠的毛發(fā)、攝食量、活動(dòng)、精神狀態(tài)及體質(zhì)量變化，每周測量尿量、24 h尿蛋白。

1.4.2 腎功能檢測 應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）的含量。

1.4.3 ELISA法檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α

水平 分別按照相應(yīng)指標(biāo)的ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.4.4 腎臟組織病理學(xué)觀察 沿腎蒂剪下殘余腎臟，以體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定后，流水沖洗過夜，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，展片，烤片，再進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）和馬松（Masson）染色，光鏡下觀察腎臟組織的改變。

1.4.5 采用qRT-PCR法測定腎組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)（1）應(yīng)用TaKaRa公司提供的RNAisoPlus提取腎組織總RNA。（2）RNA質(zhì)量檢測。通過紫外吸收法：①濃度測定；②純度檢測。（3）樣品cDNA合成：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反應(yīng)體系，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，于-80℃保存。（4）利用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)后上機(jī)。

TLR4上游引物序列為5’-GGTGCGACATCCA TACAAT-3’，下游引物序列為5’-TAGGACAGTC AGGGAGGATA-3’，片段長度為170 bp；MyD88上游引物序列為5’-CCCTGGGCAAAGACTAAGAG C-3’，下游引物序列為5’-AAGAAGGTGTCCGAG GATGGT-3’，片段長度為130 bp；NF-κB上游引物序列為5’-GCCCATTGCCTCCAACTTAAA-3’，下游引物序列為5’-ATATCTCTTTCTGACCTTGTCAC-3’，片段長度為108 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性45 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，6個(gè)循環(huán)；92℃變性45 s，68℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃擴(kuò)展延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá) 收集處理后的腎組織，在冰上用放射免疫沉淀分析（RIPA）細(xì)胞裂解液裂解，提取蛋白。通過二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸10 min，取40μg蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，洗膜后采用電化學(xué)發(fā)光（ECL）法使蛋白條帶顯色，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用ImageJ分析軟件對(duì)各組條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較圖1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組血清SCr、BUN水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組血清SCr、BUN水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.2 各組大鼠炎癥指標(biāo)比較圖2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較Figure 2 Comparison of serum IL-1β，IL-6，TNF-αlevels in rats of various groups

2.3 各組大鼠腎組織病理變化比較圖3、圖4結(jié)果顯示：假手術(shù)組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，系膜細(xì)胞和基質(zhì)無增生，腎間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤及纖維化；模型組腎小球體積增大，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變，基底膜增厚、腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤及纖維化；大蒜素低、中、高劑量組腎小球損傷減輕，系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生減輕，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性減輕，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞減少、纖維化減輕，其中，大蒜素高劑量組病理損傷最輕。

圖3 各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果比較（×200）Figure 3 Comparison of HE staining results of rat renal tissues in various groups（×200）

圖4 各組大鼠腎組織Masson染色結(jié)果比較（×200）Figure 4 Comparison of Masson staining results of rat renal tissues in various groups（×200）

2.4 各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)比較圖5結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖5 各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)比較Figure 5 Comparison of protein expression of TLR4，MyD88，NF-κB in renal tissues of rats in various groups

2.5各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κBmRNA

表達(dá)比較圖6結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組腎組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組腎組織TLR4、MyD88、NF-κBmRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

圖6 各組大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表達(dá)比較Figure 6 Comparison of mRNA expression of TLR4，MyD88，NF-κB in renal tissues of rats in various groups

3 討論

慢性腎衰竭是各類慢性腎臟病終末階段。慢性腎衰竭病理主要表現(xiàn)為間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤和炎性介質(zhì)的釋放，成纖維細(xì)胞的活化和增殖，以及過量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[15]，提示慢性腎衰竭屬于一種炎癥疾病。炎癥是誘發(fā)和加重慢性腎衰竭的因素之一。腎固有細(xì)胞在病理過程中，不僅是損傷的被動(dòng)受害者，還主動(dòng)參與調(diào)節(jié)腎臟免疫炎癥反應(yīng)[16-17]。當(dāng)腎組織受到損傷時(shí)，腎固有細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，釋放一系列炎性介質(zhì)與細(xì)胞因子等，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，與此同時(shí)還激活血小板源性生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致炎癥瀑布效應(yīng)，致使腎臟持續(xù)性損傷[18]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰竭患者C-反應(yīng)蛋白（CRP）、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥指標(biāo)升高，且炎癥指標(biāo)水平與腎功能呈一定的相關(guān)性，即腎功能下降越明顯，炎癥指標(biāo)相對(duì)越高，進(jìn)一步提示慢性炎癥反應(yīng)參與了慢性腎衰竭的發(fā)生發(fā)展[19]。

5/6腎切除大鼠模型是制備慢性腎衰竭的經(jīng)典模型[13]。本實(shí)驗(yàn)采用5/6腎切除法制備慢性腎衰竭大鼠模型，通過造成有效腎單位減少，形成“三高”（高壓力、高濾過、腎小球高灌注）狀態(tài)，最終構(gòu)建成功以腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化為病理特點(diǎn)的動(dòng)物疾病模型，其與臨床慢性腎衰竭疾病發(fā)展極其相似。研究發(fā)現(xiàn)，5/6腎切除模型同時(shí)存在免疫異常和微炎癥狀態(tài)[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，5/6腎切除模型大鼠血清SCr、BUN水平明顯升高，給予大蒜素治療后SCr、BUN水平有所下降，表明大蒜素具有保護(hù)腎臟的作用。還發(fā)現(xiàn)，模型大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，表明慢性腎衰竭大鼠處于慢性炎癥狀態(tài)；給予大蒜素治療后升高的IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降，結(jié)合大鼠腎組織病理變化來看，大蒜素亦可減輕5/6腎切除大鼠腎損害，降低其炎癥細(xì)胞浸潤，表明大蒜素可以抑制慢性腎衰竭大鼠炎癥反應(yīng)，本結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了大蒜素具有保護(hù)腎功能的作用。

TLR4是TLRs家族成員之一，主要參與感染性和自身免疫疾病的模式識(shí)別受體。TLR4在感染反應(yīng)中識(shí)別PAMPs，進(jìn)而通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活先天免疫防御，最終釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子[21]。TLR4可以激活MyD88依賴性通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和輔助刺激因子的釋放[22]。腎組織中TLR4主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過誘發(fā)炎癥反應(yīng)，參與多種病因所致的腎纖維化[23]。在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型中，TLR4突變小鼠發(fā)生腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[24]。NF-κB主要表達(dá)于腎小球細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞，TLR4經(jīng)配體刺激后，可促進(jìn)NF-κB活化，誘導(dǎo)NF-κB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腎纖維化，同時(shí)調(diào)控IL-6、IL-1β等表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[25-26]。

本研究結(jié)果顯示，5/6腎切除大鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高，用大蒜素干預(yù)后升高的TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)水平均下降，且大蒜素劑量越高，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA下降越明顯，提示大蒜素可以抑制TLR4、MyD88、NF-κB表達(dá)，且其作用效果呈劑量依賴性。

綜上所述，大蒜素可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，減少炎癥因子的釋放，減輕慢性腎衰竭大鼠炎癥反應(yīng)，進(jìn)而延緩慢性腎衰竭進(jìn)程。