熒光定量PCR 法定量檢測混合煙葉中的紅花大金元

李 萌，候寧寧，曲 鵬，王旭東，宋嘉寶，孫九喆，馬 林*

1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道136 號 450001

2. 河南中煙工業有限責任公司技術中心，鄭州市經濟技術開發區第三大街8 號 450000

煙葉是卷煙工業企業不可或缺的原料，其質量的好壞直接影響卷煙產品的吸食品質［1］。煙葉質量指標包括外觀質量、化學成分和物理特性等方面［2］，受自身生物學特性及栽培、氣候等條件的影響，不同煙葉品種在感官和理化特性上存在較大差異，其在各配方中的應用也有所不同。在煙葉收購過程中，由于不同品種煙葉收購價存在差異，混種、混區、混級等現象時有發生，從而導致煙葉質量波動、卷煙配方失真，給工業企業控制卷煙產品質量帶來影響［3］。目前煙葉原料的品種鑒定主要以感官評吸和理化檢測為主，感官評吸主觀性較強而煙葉理化指標受產地、氣候及栽培條件的影響較大［4-5］，尚缺乏生產中能夠使用的快速、客觀且準確的品種鑒定方法。

分子生物學檢測方法以物種基因組DNA 序列為檢測對象，具有干擾因素少、靈敏度高、穩定性好等優點，可彌補外觀和感官檢測的不足。RAPD、SCAR 和SSR 等分子標記技術是煙草上研究較多的分子檢測技術，可以對煙葉品種進行有效區分［6-9］。如肖炳光等［6］利用18條RAPD引物成功將29個烤煙品種進行區分；馬林等［7］采用組合標記策略，利用6個SCAR 引物準確地區分了12 個煙葉品種；孫九喆等［8］篩選出5對SSR引物，實現了11個煙葉品種的快速區分。然而，以上研究雖能對煙葉品種進行有效區分，但無法實現煙葉品種的定量檢測。

熒光定量PCR可對檢測成分進行相對定量甚至絕對定量的測定，已經普遍用于食品、飼料及藥品等特定生物成分的定性、定量檢測［10-13］，而在煙草行業中，尤其在煙葉品種的定性、定量檢測方面鮮有熒光定量PCR 應用的相關報道。為此，應用TaqMan MGB 探針熒光定量PCR 檢測混合煙葉中紅花大金元的含量，建立基于熒光定量PCR 的特定煙葉品種定量檢測方法，以期為煙葉收購和配方均一性檢測等生產環節中的煙葉品種識別、定量檢測提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

以鄭州輕工業大學煙草生物技術研究室保存的卷煙企業常用的4個烤后煙葉品種（2017年）為試驗材料，品種信息見表1。

表1 4個烤后煙葉品種及編號Tab.1 Cultivars and numbers of four cured tobacco leaf samples

1.1.2 試劑

以實驗室前期篩選的SCAR6序列為模板［14］，應用軟件 Primer Premier 5.0 設計 5 對 SCAR 引物（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成；利用上海生工在線引物設計網站（https://www.sangon.com/new Primer Design）設計 TaqMan MGB 熒光探針H1-T（表3），并由生工生物工程（上海）有限公司進行合成，該探針5′端標記熒光染料FAM，3′端標記MGB 基團；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ和 2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

表2 5對SCAR引物序列Tab.2 Sequences of 5 SCAR primer pairs

表3 熒光探針H1-TTab.3 Sequence of fluorescence probe H1-T

1.1.3 儀器

JXSF TPRP-2 組織研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）；NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Vetiti型梯度PCR儀（美國ABI公司）；Mini Bis Pro 型凝膠成像分析系統（以色列DNR 凝膠成像系統有限公司）；StepOnePlus 型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

紅花大金元、云煙85、云煙87 與K326 4 個品種煙葉樣品各取0.1 g至1.5 mL離心管中，應用組織研磨儀磨成粉末（2 min，65 Hz），然后參照改良后的CTAB 法［15］操作步驟提取DNA，利用超微量紫外分光光度計和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的濃度及質量。最后將 DNA 稀釋至55 ng·μL-1，-20 ℃保存。

1.2.2 紅花大金元特異性引物篩選

SCAR-PCR 擴增反應體系（20 μL）：DNA 模板，55 ng·μL-1、0.5 μL；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ，10μL；上下游引物，10 μmol/L 濃度各0.5 μL；ddH2O 加至20 μL；反應程序為：94 ℃預變性6 min；94 ℃變性50 s，引物的退火溫度根據表2 結果退火20 s，72 ℃延伸25 s，從變性到延伸反應30 個循環；最后在72 ℃延伸6 min；PCR 產物在4 ℃條件下保存。PCR擴增產物在80 V穩定電壓下，以1×TAE作為電泳緩沖液，將質量分數為1.5%的瓊脂糖凝膠置于緩沖液中，上樣后電泳40 min，經由紫外凝膠成像系統拍照后，建立凝膠電泳圖進行分析。根據電泳結果最終選出特異性強且能產生特異性條帶的SCAR引物用于紅花大金元品種鑒定。

1.2.3 引物與探針特異性測試

利用篩選好的特異性引物與探針H1-T組合，分別以紅花大金元、云煙85、云煙87 和K326 基因組DNA 為模板進行引物與探針特異性測試。熒光定量PCR反應體系如表4所示，反應程序為：37 ℃污染消化2 min；95 ℃預變性5 min；在 95 ℃變性10 s、49 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s 條件下循環 40 次，在此過程收集數據。以ddH2O 為空白對照，根據引物探針組合的擴增曲線形態（S）、Ct 值確定引物的特異性。

1.2.4 熒光定量PCR擴增體系及程序優化

根據引物、探針組合的擴增曲線形態（S）、Ct 值確定最佳引物，設置4 個模板DNA 含量梯度（1、2、3和4 μL），以紅花大金元DNA 為模板按照1.2.3 程序進行擴增。

1.2.5 方法靈敏度測試

將紅花大金元基因組DNA 用ddH2O 進行梯度稀釋，DNA 的濃度分別為 55、5.5、0.55、0.055 和0.005 5 ng·μL-1。利用優化后的熒光定量PCR 擴增體系和擴增程序進行擴增。

1.2.6 標準曲線建立

將紅花大金元基因組 DNA（55 ng·μL-1）與ddH2O 混合稀釋成不同濃度，紅花大金元基因組DNA稀釋后的濃度分別為5.5、11.0、16.5、22.0、27.5、33.0、38.5、44.0、49.5 和 55.0 ng·μL-1。將 2 μL 紅花大金元基因組DNA 加入到20 μL 反應體系后，其實際濃度分別為0.55、1.10、1.65、2.20、2.75、3.30、3.85、4.40、4.95 和5.50 ng·μL-1。利用以上的紅花大金元基因組DNA為模板，通過優化后的熒光定量PCR擴增體系和擴增程序進行擴增。以紅花大金元基因組DNA 在20 μL 反應體系中的實際濃度為橫坐標，Ct值均值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 煙葉基因組DNA預混樣品測定

將紅花大金元基因組DNA 與云煙85 基因組DNA 按照不同體積比例進行混合。實驗中混合樣品比例設計如表5 所示，紅花大金元基因組DNA 與云煙85的基因組DNA體積比分別為5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，分別用A、B、C、D、E、F表示，以紅花大金元煙葉DNA為模板，用引物與探針組合對樣品進行熒光定量PCR擴增，每個樣品重復3次，根據熒光定量PCR擴增及標準曲線對紅花大金元進行定量分析。

1.2.8 混合煙葉樣品測定

將紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和K326進行混合并編號。1～3 號樣品為紅花大金元分別與云煙 85、云煙 87 和 K326 按照質量比 5 ∶5 進行混合；4～6 號樣品分別為紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和 K326 按照質量比 7 ∶3 進行混合；7～9 號樣品分別為紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和K326 按照質量比9∶1進行混合。將上述樣品磨成粉末，各取0.1 g 于1.5 mL 離心管中，利用改良的CTAB 法提取上述混合樣品的基因組DNA，將提取后的DNA 用ddH2O稀釋至55 ng·μL-1，并使用熒光定量PCR法進行檢測，每個樣品重復3次。

2 結果與討論

2.1 烤后煙葉基因組DNA提取

由圖 1 可看出，1～4 號樣品 DNA 條帶都較為清晰單一，無雜帶，主條帶亮度高且DNA 條帶完整性較好。由表6 可知，提取的基因組DNA OD260/OD280的值在1.8～2.0 之間，純度較高。利用改良的CTAB法提取的煙葉基因組DNA 質量及純度達到后續PCR 對DNA 模板的要求。將4 個煙葉樣品的DNA用ddH2O稀釋至55 ng·μL-1，備用。

表6 煙葉基因組DNA濃度與純度檢測結果Tab.6 Concentration and purity of tobacco genomic DNA

圖1 煙草基因組DNA凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoregram of tobacco genomic DNA

2.2 紅花大金元特異性引物篩選

以紅花大金元、云煙85、云煙87與K326基因組DNA 為模板，對所設計的5 對引物進行篩選。PCR反應條件為1.2.2 節的SCAR-PCR 反應體系與程序。結果（圖2）顯示，只有引物H1-R/F 以紅花大金元基因組DNA 為模板進行PCR 時可擴增出明亮的條帶，無其他雜帶產生，表明引物H1-R/F 對紅花大金元基因組DNA有很強的特異性，可用于紅花大金元品種的定性鑒定。

圖2 引物篩選結果Fig.2 Screening results by using primers

2.3 引物與探針特異性測試

熒光定量PCR 擴增產物大小在80～200 bp 較為適宜，實驗中設計篩選出的引物H1-R/F 符合該要求。利用熒光引物H1-R/F 與探針H1-T 組合，以紅花大金元、云煙85、云煙87 和K326 的基因組DNA為模板進行特異性測試。結果（圖3）顯示，紅花大金元出現典型的擴增曲線，其余樣品雖有擴增曲線，但Ct 值均大于32，可判定為陰性。以上結果表明該引物、探針組合具有良好的特異性，可以用于下一步試驗。

圖3 特異性測試結果Fig.3 Test results for specificity

2.4 熒光定量PCR擴增體系及程序優化

利用引物與探針組合H1-R/F/T，設置4 個模板DNA含量梯度（1、2、3和4 μL），進行PCR擴增，確定熒光定量PCR 最佳反應體系。結果如表7 所示，Ct值隨著模板DNA 含量的增加而減小。熒光定量PCR Ct值要求在25～30之間，故確定模板DNA的含量為2 μL。

表7 熒光定量PCR體系優化Ct值Tab.7 Ct values of optimized fluorescent quantitative PCR system

2.5 方法靈敏度測試

將紅花大金元基因組DNA 用ddH2O 梯度稀釋，利用優化后的熒光定量PCR擴增體系和擴增程序進行擴增以確定該方法的檢測限。結果（圖4）表明，當紅花大金元DNA初始濃度大于0.055 ng·μL-1時，擴增曲線的Ct 值≤32；當紅花大金元DNA 初始濃度在0.055 ng·μL-1以下時，擴增曲線的Ct 值＞32，模板DNA含量為2μL，可得本方法的檢測限為0.11 ng。

圖4 靈敏度測試結果Fig.4 Test results for sensitivity

2.6 標準曲線繪制

按照1.2.6節所述方法繪制標準曲線。從結果可以看出（圖5、表8），Ct值的RSD范圍在0.05%～0.38%之間，重復性較好；標準曲線方程為y =-1.575ln（x）+ 27.156，決定系數R2為0.997。

表8 紅花大金元熒光定量PCR方法標準曲線Ct值Tab.8 Ct value of standard curve of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan

圖5 標準曲線Fig.5 Standard curve

2.7 預混樣品中紅花大金元含量測定

將紅花大金元 DNA（55 ng·μL-1）與云煙 85 DNA（55 ng·μL-1）按照表5的方式進行混合，以上述DNA 預混樣品為模板進行熒光定量PCR。從結果（表9）可以看出，Ct值的RSD范圍在0.04%～0.33%之間，重復性較好，數據穩定可靠。通過標準曲線計算得出預混樣品A～F 中紅花大金元DNA 含量檢測值分別為51.36%、61.95%、72.17%、81.18%、87.95%和97.29%，檢測值與理論值相對誤差分別是2.72%、3.25%、3.10%、1.48%、-2.28%和-2.71%。相對誤差均在3.5%以下，表明標準曲線可以對混樣中紅花大金元含量進行定量分析。

表9 預混樣品中紅花大金元熒光定量PCR法檢測結果Tab.9 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in premixed samples

2.8 混合煙葉樣品中紅花大金元含量測定

從表 10 可以看出，1～9 號混合煙葉樣品 Ct 值重復性較好。應用標準曲線計算得出煙葉混合樣品中紅花大金元的DNA 濃度，通過紅花大金元的DNA濃度和混合煙葉樣品DNA濃度之比得出1～9號樣品中紅花大金元的含量（表10）。紅花大金元的檢測值均值與理論值的差值在2.5%～3.5%之間，且每個樣品3次重復計算得出紅花大金元檢測值的變異系數小于2%，屬于弱變異，結果波動較小。

表10 混合煙葉樣品中紅花大金元熒光定量PCR檢測結果Tab.10 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in mixed tobacco leaf samples

基于熒光定量PCR的煙葉品種定量檢測技術的核心在于引物的特異性。本研究中以紅花大金元品種特異性序列為基礎建立了該品種的定量檢測方法，當鑒定靶標品種改變時，需要根據靶標品種的特異性序列重新設計、篩選引物，參照本研究中的流程建立其檢測方法。本研究中所用混合樣品包含了4個煙葉品種，當品種范圍擴大時，需要以新加入品種為模板對引物的特異性進行驗證以避免出現假陽性。此外，由于熒光探針法靈敏度較高，對DNA 模板質量和操作精度要求較高，檢測過程各個環節均需嚴格、規范操作以確保實驗結果的準確性。

3 結論

通過特異性引物設計、篩選、探針引物組合特異性測試和熒光定量PCR 擴增條件的優化，利用TaqMan MGB 探針法實現了混合煙葉中紅花大金元品種的定量檢測。以紅花大金元品種特異性SCAR序列為基礎設計了熒光定量引物和探針，從中篩選出了特異性強、靈敏性高、重復性好的引物和探針組合，在此基礎上繪制了標準曲線，最終建立了紅花大金元在混合煙葉樣品中的定量檢測方法。該方法的檢測限為0.11 ng，誤差范圍在2.5%～3.5%之間，精確度高、檢測周期短、安全性好，可應用于特定混合樣品中紅花大金元煙葉的定量檢測，為煙葉品種的定量檢測提供了新的技術手段。